【摘 要】
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该论文从6036酶降解壳聚糖活性检测手段入手,研究了影响酶活性的一系列因素,同时对现有的实验方法进行了比较,确定了纯化的条件,设计出一套合理而可行的实验方案,对6036酶进
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该论文从6036酶降解壳聚糖活性检测手段入手,研究了影响酶活性的一系列因素,同时对现有的实验方法进行了比较,确定了纯化的条件,设计出一套合理而可行的实验方案,对6036酶进行了初步的分离与纯化,获得了以下结果.1.考察了6036酶活性检测方法,最终选择PAHBAH还原糖测定方法作为酶活性的测定方法.2.研究了影响酶活的因素.降解壳聚糖的最佳介质为醋酸溶液;底物浓度范围在0-15g/l时6036酶酶活随酶浓度增加而增大;6036酶最适反应温度为40-50℃;反应最适pH值为4-5;在金属离子浓度为0-1M时,一价K<+>、Na<+>离子对6036酶酶活主要是促进作用;而二价Ca<2+>离子对6036酶酶活影响在低于0.25M时促进,高于该浓度时抑制;但Mg<2+>离子主要起抑制酶活的作用.3.通过实验对现有的层析填料和层析柱套盒进行了筛选,选择了DEAE-Sepharose,Superose12和HA层析填料作为6036酶初步纯化的层析用料.4.设计出一套较为合理而有效的纯化6036酶的方案,首先采用DEAE-Sepharose离子交换层析,收集活性蛋白质峰冷冻干燥后经Superose12凝胶过滤层析除盐同时转换缓冲体系,将蛋白质峰合并浓缩后上样至HA层析柱进行分离,同时用电泳检测分离与纯化效果.分离前后条带数目由原来的25条减少至8条,而比活性则增加了24倍.该论文为完全分离纯化6036酶提供了基本实验方案,为获得高纯度的降解酶打下了前期工作基础.可通过进一步纯化酶,以酶蛋白测定蛋白质顺序,来设计PCR引物,克隆目标基因.
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