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相关背景及研究目的：
自噬是广泛存在于真核细胞中的一条胞内蛋白的降解途径，它主要对体内的长寿蛋白及一些细胞器进行降解。自噬是一个进化保守的细胞生物学行为，其分子机制从酵母到哺乳动物十分相似。在自噬过程中，待降解的胞浆组分及细胞器被包裹在一种被称为自噬小体的双层膜结构中，最终与溶酶体融合形成自噬溶酶体，实现胞内物质的降解。在哺乳动物细胞发生自噬的过程中，涉及到两种泛素样加工修饰系统：Atg-12结合系统和LC3修饰系统。Atg-12结合系统对于前自噬小体的形成是非常重要的，而LC3修饰系统则与自噬小体的形成密切相关。LC3有两种形式：游离型的LC3-Ⅰ及膜结合型的LC3-Ⅱ。目前认为，LC3-Ⅱ是自噬小体的特征性标记。
肝癌（HCC）是恶性程度极高、且预后极差的恶性肿瘤之一，严重威胁人类的健康。治愈性切除手术或肝移植是目前肝癌病人首选的治疗方法，但由于肝癌的肝内多发病灶、肝外转移及供体缺乏等因素，新诊断出的肝癌病人只有10％～15％可采取手术治疗。临床资料显示，大部分肝癌病人对化疗、放疗等治疗不敏感，因此，肝癌的临床治疗迫切需要新的方法和手段。肿瘤生物治疗作为一种新的肝癌治疗策略，具有特异性强、毒副作用小等优点，越来越受到人们重视。其中，以树突状细胞（DC）为载体的肝癌疫苗目前已成为肝癌生物治疗的研究热点。
pAPC交叉递呈的抗原多肽是诱导特异性效应细胞的物质基础、而肿瘤细胞直接递呈的抗原多肽是效应细胞有效识别并杀伤肿瘤细胞的靶点。一方面，肿瘤细胞直接递呈的抗原多肽主要来源于肿瘤细胞的短寿蛋白（平均半衰期约为10分钟）；另一方面，pAPC交叉递呈的抗原多肽主要来源于肿瘤细胞的长寿蛋白（经自噬途径降解），两者间可能存在着不对称现象，因此，解决上述的不对称性是肿瘤免疫需要解决的课题。
本研究结合前期的工作基础，以转HBV全基因人肝癌细胞株-HepG2．215为靶细胞，采用蛋白酶体抑制剂阻断肿瘤短寿蛋白的降解，促使其进入自噬途径，达到募集短寿蛋白的目的；采用自噬小体诱导剂促进自噬形成；采用NH4Cl抑制溶酶体功能，阻止溶酶体对自噬小体中蛋白的降解。在此基础上摹集自噬小体（Drips ill blebs，简称DRibble），对DRibble的生物学特性进行初步研究。
方法：
1．HepG2．215细胞体外常规培养，待细胞状态良好密度合适时，加入不同的药物阻断蛋白酶体降解途径、促进自噬、抑制溶酶体酸化等，诱导并摹集各种DRibble；
2．采用分步高速离心法将DRibble提取出来，并用PBS重悬分装；
3．透射电子显微镜观察DRibble的形态；
4．荧光定量PCR定量检测HepG2．215细胞及DRibble中HBV-DNA的含量；
5．以HBsAg为靶蛋白，采用ELISA法检测DRibble及细胞裂解物中HBsAg的含量及其变化；
6．Western blot检测各组细胞裂解物中HBsAg及其变化，并检测自噬小体特征
性标志物-LC3-Ⅱ的水平；
7．淋巴结注射DRibble方法免疫Balb/c小鼠，2周后皮下注射DRibble增强免疫，检测小鼠血清中抗HBs抗体的产生情况；
8．以HBsAg预先免疫小鼠，收获免疫小鼠的脾脏及淋巴结，制成混合淋巴细胞悬液，以可溶性HBsAg、DRibble或裂解物体外刺激72小时，收集细胞培养上清并以ELISA法检测其IFN-γ与IL-4水平；
9．磁珠分选出免疫小鼠的CD8+与CD4+T细胞，上述抗原与DC共孵育6小时后洗去抗原，然后与T细胞共培养72小时，检测上清中IFN-γ与IL-4含量；
10．以DRibble预先免疫小鼠，收获免疫小鼠的淋巴细胞，体外分别用可溶性HBsAg、DRibble以及细胞裂解液刺激72小时，ELISA法检测其IFN-γ与IL-4。
结果：
1．透射电子显微镜观察到含双层膜结构的小体，提示有效地提取了自噬小体/DRibble；
2．荧光定量PCR检测到HepG2．215细胞中含有高水平的HBsAg-DNA，而从DRibble中未检测到HBsAg-DNA；
3．ELISA法检测HBsAg显示：蛋白酶体抑制剂能够阻断HBsAg短寿蛋白的降解，自噬诱导剂能够促进自噬小体的形成及外排，NH4Cl能够阻止溶酶体对自噬小体中蛋白的降解，从而使自噬小体生成增多、降解减少，HBsAg蛋白含量相应地增加；
4．Western blot检测HBsAg显示：在蛋白酶体抑制剂作用下，HBsAg短寿片段得以保留，NH4Cl抑制溶酶体对自噬小体中蛋白的降解，使HBsAg长短片段均得以富集；在各组细胞裂解物中，均检测到自噬特异性标记物LC3，且以胞浆型的LC3-Ⅰ为主，NH4Cl处理组LC3含量最多；在各组DRibble中，检测到的LC3以膜结合型的LC3-Ⅱ为主，且NH4Cl处理组LC3-Ⅱ的含量明显高于其他组；
5．DRibble免疫小鼠血清能检测到高水平的抗HBs抗体；
6．DRibble在体外单独刺激HBsAg免疫小鼠淋巴细胞时能够产生高水平的IFN-γ和低水平的IL-4，IFN-γ水平显著高于可溶性HBsAg刺激组和细胞裂解液刺激组，而且DRibble的最强刺激剂量是可溶性HBsAg的1/300；
7．DC/DRibble和DC/HBsAg刺激HBsAg特异性CD4+T细胞产生的IFN-γ水平无明显差别；但DC/DRibble刺激HBsAg特异性CD8+T细胞产生的IFN-γ水平显著高于DC/HBsAg刺激组和细胞裂解液刺激组；
8．体外用DRibble对DRibble免疫小鼠淋巴细胞进行再刺激时可产生高水平的IFN-γ，而细胞裂解液则不能很好地活化T细胞，仅产生很少量的IFN-γ。
结论：
1．蛋白酶体抑制剂联合自噬诱导剂和NH4Cl能促进肝癌细胞自噬小体的形成，降低蛋白酶体对HBsAg的降解，并诱导自噬小体的释放；
2．DRibble作为一种新型交叉提呈的抗原载体，体外诱导HBsAg特异性CD8+T细胞活化的能力明显优于可溶性HBsAg以及肿瘤细胞裂解液。