中国热带和亚热带地区孢囊线虫的形态及分子生物学鉴定

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孢囊线虫是一种重要的植物病原线虫,但在我国南方的热带和亚热带地区还很少有孢囊线虫的研究。本文从中国南方热带和亚热带地区的海南、广东、广西、福建、湖南和江西6个省或自治区的水稻、草、竹子、胡椒、甘蔗等作物的根和根际土壤中分离孢囊线虫,取得了以下主要结果:  1.分离到15个孢囊线虫种群,分别隶属于2个属--孢囊线虫属(Heterodera)和隐皮孢囊线虫属(Cryphodera),其中13个种群为孢囊线虫属线虫,2个种群为隐皮孢囊线虫属线虫。  2.运用比较形态学分子生物学相结合的方法,鉴定了3个新种,分别定名为冯氏孢囊线虫(Heterodera fengi n.sp.)、广东孢囊线虫(Heterodera guangdongensis n.sp.)和海南孢囊线虫(Heterodera hainanensis n.sp.)。冯氏孢囊线虫主要形态特征是:阴门锥为双半膜孔,无下桥和泡囊;雄虫4条侧线,口针基部球略呈锚状,平均长25.1μm,交接刺末端不对称2叉状,平均长29.8μm;2龄幼虫3条侧线,口针基部球锚状,平均长23.2μm。其近似种是水稻孢囊线虫,区别在于:新种雄虫口针更长(24.5-26.3μm vs.20.7-24.9μm),DGO值更大(5.0-6.0μm vs.3.0-5.0μm),阴门锥无下桥和泡囊(vs.存在下桥和泡囊)。广东孢囊线虫主要形态特征是:阴门锥为双半膜孔,下桥明显,无泡囊;雄虫4条侧线,口针基部球略呈锚状,平均长22.4μm,交接刺末端对称2叉状,平均长24.1μm;2龄幼虫3条侧线,口针基部球锚状,平均长20.6μm。该新种的最相似种是H.phragmitidis,两者的区别在于:新种的二龄幼虫口针更长(19.8-21.0μm vs.18-19μm)、DGO更大(6.0-7.0μm vs.3.6-4.8μm)、孢囊更小(334.9-398μm×275.2-331.5μm vs.488-679μm×394-585μm)、雄虫交合刺(22.0-26.0μm vs.28.6-41.6μm)和引带(7.8-8.0μm vs.11.7-14.3μm)更短。海南孢囊线虫主要形态特征是:阴门椎无膜孔和泡囊,具细的下桥;2龄幼虫3条侧线,口针平均长16.6μm。该新种的最近似种是朝鲜孢囊线虫,两者区别在于:前者阴门椎具下桥,后者无下桥;新种的孢囊、阴门裂和生殖原基均更小。同时还提供了这3个新种的rDNA-ITS-RFLP图谱、28S rDNAD2D3序列和rDNA-ITS序列。另外还鉴定了1个中国新记录种--朝鲜孢囊线虫(H.koreana);1个重要病原孢囊线虫--寄生水稻的日本孢囊线虫(H.elachista)和1个中国新记录属--隐皮孢囊线虫属。  3.运用贝叶斯法构建了本文鉴定的孢囊线虫的28S rDNA D2D3和rDNA-ITS的分子系统进化树,并结合形态学对它们进行分组研究。结果明确冯氏孢囊线虫新种、广东孢囊线虫新种和日本孢囊线虫属于莎草组(Cyperi group),海南孢囊线虫新种和朝鲜孢囊线虫属于无膜孔组(Afenestrata group),表明目前在我国热带和亚热带地区的孢囊线虫主要属于莎草组和无膜孔组。  4.采用双重PCR(duplex-PCR)方法对冯氏孢囊线虫和广东孢囊线虫这两个新种进行快速诊断与鉴定。结果显示冯氏孢囊线虫可获得约1000 bp和300 bp两条带、广东孢囊线虫可获得1000 bp和500 bp两条带、而其它孢囊线虫仅有1000 bp一条带,未扩增到其它杂带,表明该体系可同时快速鉴定冯氏孢囊线虫和广东孢囊线虫两个新种,而且仅需要单条2龄幼虫提取模板DNA,是一个快速、简单且可靠的方法。  综上所述,本研究对我国南方热带与亚热带地区的海南、广东、广西、福建、湖南和江西6个省或自治区的孢囊线虫进行调查鉴定,发现在上述地区均有孢囊线虫分布,而且种类丰富,包括3个新种、1个新记录属和1个新记录种。这项工作不仅拓展了我国孢囊线虫的地理分布和种类范围,更重要的是该工作表明在我国的热带和亚热带地区孢囊线虫分布较广,改变了原来人们认为孢囊线虫在我国主要分布在北方温带地区而在南方地区很少分布的观点。而且本研究在水稻上分离到日本孢囊线虫,该线虫是水稻的一个重要病原线虫,可引起水稻7-19%的损失,表明在我国南方地区孢囊线虫病害应引起我们的重视。本研究为今后进一步研究热带和亚热带地区孢囊线虫的多样性、起源、危害及防治奠定了基础,具有重要的理论价值。
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