应用酵母双杂交技术筛选猪Calsarcin-2蛋白结合蛋白

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Calsarcin(Calcineurin-associated sarcomeric protein,CS)钙调神经磷酸酶相关肌原蛋白家族是一个与钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)结合的具横纹肌特异性蛋白质新家族,现已发现的CS家族成员包括Calsarcin-1(CS-1)、Calsarcin-2(CS-2)和Calsarcin-3(CS-3)。在胚胎发育过程中CS-1和CS-2在心肌和骨骼肌中表达,但在成人组织中,CS-1在心肌和慢肌纤维中表达,CS-2仅在骨骼肌快肌纤维中表达。CS不仅与控制心肌肥大和骨骼肌中慢肌纤维基因表达的钙离子依赖的信号传导途径相关,同时CS还作为CaN的底物将CaN与肌肉收缩元件联系起来,并且还为调节肌肉活动性的潜在配体,研究证明CS不仅能通过调节相关基因的表达控制肌纤维分化及发育过程,且参与钙离子信号传导途径。因此,在横纹肌中CS作为CaN的特异性催化底物并具有调控其功能的作用,同时还参与Z线形成及其结构的维持。本实验利用酵母双杂交技术筛选猪骨骼肌中CS-2K作蛋白,深入研究CS-2在猪骨骼肌纤维形成和信号通路调控中的功能,将有助于了解猪肌纤维形成机理,不仅为猪肉生产提供了分子理论,还为猪品种的改良提供了试验依据。同时为深入研究心肌肥大及肌营养不良等疾病提供了一定的理论基础。主要研究成果如下:1.利用生物信息学和比较基因组学的方法克隆得到了猪的CS-2基因,并克隆到pGBKT7诱饵表达载体中,获得了有表达活性且无毒性的pGBKT7-CS2诱饵表达载体。2.分离、纯化了猪骨骼肌组织的ds cDNA,将纯化的cDNA及pGADT7-Rec载体共转化AH109酵母感受态细胞。成功地构建了猪骨骼肌cDNA文库。3.将诱饵载体转化Y187酵母感受态细胞中,并与文库混合进行酵母双杂交,初步筛选到与CS-2互作的180个阳性克隆。4.经PCR鉴定、酶切、测序及结果分析,获得了3个感兴趣的互作蛋白,其中骨骼肌α-1-肌动蛋白(α-1-actin)参与肌肉收缩过程,肌联蛋白(titin)调节肌小节动力传导及Z盘装配,钙调素1(calmodulin 1)参与钙离子信号传导。结果提示,CS-2具有维持Z盘结构稳定和参与钙离子信号传导的功能。
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