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背景与目的矽肺是由于长期吸入含有游离二氧化硅（SiO2）粉尘而引起的以肺组织纤维化为主的全身性疾病,我国矽肺病例约占尘肺总病例50%,是危害最严重的一种尘肺病。矽肺纤维化发病的分子机制研究至今虽尚未完全阐明,有研究表明矽肺的发生与溶酶体酶有关。吸入的SiO2对肺泡巨噬细胞（alveolar macrophage,AM）溶酶体的损伤及伴随的溶酶体酶向胞浆的释放在矽肺的发病机制中起重要作用。溶菌酶（lysozyme,LSZ）是巨噬细胞溶酶体中主要的水解酶之一,肺泡巨噬细胞溶菌酶可能成为一种致纤维化因子,刺激肺组织成纤维细胞增殖,导致胶原的过量合成和沉积,加速矽肺纤维化的形成。并且有研究表明LSZ比其它溶酶体水解酶更易释放。所以本实验采用溶菌酶作为肺泡巨噬细胞的标志酶进行研究。本实验室前期的工作中,通过免疫组织化学、免疫细胞化学、RT-PCR的方法证明了矽尘能刺激肺泡巨噬细胞内溶菌酶表达增加,在此基础上,我们设想在矽肺的发生发展过程中,SiO2作用于肺泡巨噬细胞以后,是否可用某种药物在细胞水平和蛋白水平上抑制SiO2诱导肺泡巨噬细胞内溶菌酶的表达上调,从而减缓对巨噬细胞和肺组织的损伤,阻止矽肺纤维化的形成。本实验研究以溶菌酶作为大鼠肺泡巨噬细胞的标志酶,应用Western Blotting蛋白免疫印迹法对染矽尘后肺泡巨噬细胞加入不同浓度吲哚美辛（Indomethacin,IND）,观察SiO2诱导的肺泡巨噬细胞（AM）中溶菌酶蛋白的表达有无变化,吲哚美辛对SiO2诱导的肺泡巨噬细胞（AM）中溶菌酶的蛋白表达有无抑制作用。从蛋白质水平探讨吲哚美辛对二氧化硅诱导的肺泡巨噬细胞溶菌酶表达的影响,以期为进一步认识矽肺发病机制提供实验依据。实验分组与方法本实验分为二个部分1.细胞实验采用倒置显微镜观察细胞形态学改变:按改良的Myrivk法在无菌条件下进行大鼠支气管肺泡灌洗,灌洗液经1500 rpm离心15 min,弃上清,用PBS（phosphate buffer saline,PBS）洗涤一次,合并混匀,加入含10%小牛血清的RPMI1640培养基,放入37℃,5%CO2培养箱培养,2 h后用PBS洗涤,洗去杂细胞和未贴壁的肺泡巨噬细胞,即得较纯的AM。将纯化的AM换入不含小牛血清的RPMI1640培养基中,按是否加入SiO2和吲哚美辛处理分为对照组、模型组和干预组。干预组又分为低、中、高三个剂量依次为10-5g/ml、10-4g/ml、10-3g/ml,分别用IND1、IND2、IND3表示。模型组加入SiO2 50μg/ml粉尘悬液复制矽尘中毒模型,干预组在加入SiO2 50μg/ml粉尘悬液的同时加入相应浓度的IND;对照组给予同体积PBS。37℃培养8 h后在倒置显微镜上拍摄细胞图片。2.Western Blotting蛋白免疫印迹实验将上述处理的肺泡巨噬细胞（AM）在培养8 h、16 h后收集的细胞,按分组进行蛋白质提取。再将所提取的蛋白质进行Western Blotting蛋白免疫印迹实验,检测LSZ在AM中的表达,并用Quantity One软件结合图像对LSZ的表达进行半定量分析。结果1.细胞实验:纯化并经过处理的肺泡巨噬细胞（AM）在37℃,5%CO2培养箱培养8 h后在倒置显微镜下拍照,发现对照组细胞贴壁生长良好。模型SiO2组经50μg/mlSiO2刺激8h后肺泡巨噬细胞肿胀变形,并出现细胞碎片。而干预组加入吲哚美辛药物的AM细胞形态与模型组相比较细胞相对完整,且有浓度依赖趋势。2.Western Blotting蛋白免疫印迹实验:经50μg/ml SiO2刺激8h、16h后,模型组肺泡巨噬细胞内LSZ蛋白表达与阴性对照组相比明显上调,干预组加药后对SiO2诱导的肺泡巨噬细胞内LSZ蛋白表达均有下降趋势。1)模型组AMS在8 h和16 h两个时间点溶菌酶（LSZ）蛋白表达均高于对照组,分别是对照组的1.945、2.285倍,差异均有统计学意义（P＜0.0125）。2)干预组在8 h和16 h两个时间LSZ蛋白表达均低于模型组,在8 h时间点与模型组比较（分别是对照组的1.586、1.055、0.864倍）,中、高剂量组的差异均有统计学意义（P＜0.0125）;在16 h时间点LSZ蛋白表达低于模型组（分别是对照组的1.544、1.481、0.908倍）,与模型组比较仅高剂量组的差异具有统计学意义（P＜0.0125）。结论本研究在分析国内外矽肺发病机理的基础上,提出矽尘可诱导肺泡巨噬细胞溶菌酶蛋白表达增加的设想,并通过Western Blotting蛋白免疫印迹法在蛋白水平上证明矽尘可诱导肺泡巨噬细胞溶菌酶表达的增加,为阐明矽肺发病机制提供了新的科学依据。根据吲哚美辛可抑制溶酶体酶释放的药理作用,对染矽尘细胞进行干预,证明吲哚美辛可使经SiO2粉尘刺激的肺泡巨噬细胞内LSZ蛋白表达下调,同时发现吲哚美辛对肺泡巨噬细胞膜有一定的保护作用,可减轻SiO2对肺泡巨噬细胞膜的损伤作用,为矽肺病的防治措施的研究提供了新思路。