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果实采后成熟过程不仅决定了货架期的长短也是影响果实品质的重要因素。猕猴桃（Actinidia spp.）果实是一种呼吸跃变型果实，在采后贮藏过程中会释放大量乙烯并迅速软化。软化后的果实食用品质显著提升，但过度/不可控的软化会严重影响果实的货架期，造成极大的采后损耗。本文研究miRNA对猕猴桃果实采后成熟的调控机制。通过生物信息学分析、基因表达、烟草双荧光素酶、酵母杂交、双分子荧光互补等技术手段，阐明了猕猴桃果实采后成熟过程中miR164-NAC途径的调控机制。主要研究结果如下：
1、对18个猕猴桃果肉样品（不同处理和取样点的样品）进行小RNA文库构建并测序。通过与‘红阳’猕猴桃参考基因组比对和miRdeep2软件分析，共预测得到271个miRNA及其前体，所有前体的序列包含一段典型的茎环结构。成熟miRNA长度主要为21nt和24nt，其中88个miRNA为保守miRNA，分别属于23个保守miRNA家族，可在拟南芥、水稻或番茄中找到同源序列。
2、通过小RNA-降解组-转录组关联分析，共鉴定出22个候选靶基因。其中，AdNAC6和AdNAC7为Ade-miR164的靶基因，转录组数据表明它们的表达均受外源乙烯处理强烈诱导。通过实时荧光定量PCR技术（RT-qPCR），发现成熟Ade-miR164和它的一个前体Ade-MIR164b的表达量受到外源乙烯的抑制，且其表达量在果实正常后熟过程中都呈现逐步下降的趋势；AdNAC6和AdNAC7的表达则呈相反趋势。miRNA双荧光素酶体系证明Ade-MIR164b可产生成熟的miRNA，并作用于AdNAC6和AdNAC7编码区上特定的靶序列。通过启动子活性分析，发现AdNAC6和AdNAC7启动子的活性不受乙烯调控，而Ade-MIR164b启动子的活性会被乙烯强烈抑制。结合可视萤火虫荧光体系，认为miR164-NAC途径参与调控猕猴桃的采后成熟进程，并且乙烯不直接调控AdNAC6和AdNAC7的表达，而是通过改变Ade-miR164的表达来实现的。
3、进一步分析，发现AdNAC6和AdNAC7可激活乙烯生物合成基因（1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶，AdACS1；1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶，AdACO1）、细胞壁降解基因（β-内切甘露聚糖酶，AdMAN1）和萜烯类物质合成基因（萜烯合酶，AaTPS1）的启动子。EMSA结果表明，AdNAC6和AdNAC7蛋白可直接结合这些基因启动子的顺式作用元件。亚细胞定位结果表明，AdNAC6和AdNAC7蛋白主要分布于细胞质中。当利用序列突变排除miR164的影响时，AdNAC6和AdNAC7蛋白则会出现在细胞核中。这可能是因为排除miR164的影响时，AdNAC6和AdNAC7蛋白大量表达，有更多的机会形成同源或异源二聚体进而进入细胞核中。双分子荧光互补实验、酵母双杂实验和萤火虫荧光素酶互补成像实验证实了这个观点。在不同种类果实中克隆miR164的前体序列和NAC基因，并通过靶基因预测、miRNA双荧光素酶实验和进化树分析，认为miR164-NAC途径对不同种类果实的成熟调控存在保守性。
1、对18个猕猴桃果肉样品（不同处理和取样点的样品）进行小RNA文库构建并测序。通过与‘红阳’猕猴桃参考基因组比对和miRdeep2软件分析，共预测得到271个miRNA及其前体，所有前体的序列包含一段典型的茎环结构。成熟miRNA长度主要为21nt和24nt，其中88个miRNA为保守miRNA，分别属于23个保守miRNA家族，可在拟南芥、水稻或番茄中找到同源序列。
2、通过小RNA-降解组-转录组关联分析，共鉴定出22个候选靶基因。其中，AdNAC6和AdNAC7为Ade-miR164的靶基因，转录组数据表明它们的表达均受外源乙烯处理强烈诱导。通过实时荧光定量PCR技术（RT-qPCR），发现成熟Ade-miR164和它的一个前体Ade-MIR164b的表达量受到外源乙烯的抑制，且其表达量在果实正常后熟过程中都呈现逐步下降的趋势；AdNAC6和AdNAC7的表达则呈相反趋势。miRNA双荧光素酶体系证明Ade-MIR164b可产生成熟的miRNA，并作用于AdNAC6和AdNAC7编码区上特定的靶序列。通过启动子活性分析，发现AdNAC6和AdNAC7启动子的活性不受乙烯调控，而Ade-MIR164b启动子的活性会被乙烯强烈抑制。结合可视萤火虫荧光体系，认为miR164-NAC途径参与调控猕猴桃的采后成熟进程，并且乙烯不直接调控AdNAC6和AdNAC7的表达，而是通过改变Ade-miR164的表达来实现的。
3、进一步分析，发现AdNAC6和AdNAC7可激活乙烯生物合成基因（1-氨基环丙烷-1-羧酸合酶，AdACS1；1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶，AdACO1）、细胞壁降解基因（β-内切甘露聚糖酶，AdMAN1）和萜烯类物质合成基因（萜烯合酶，AaTPS1）的启动子。EMSA结果表明，AdNAC6和AdNAC7蛋白可直接结合这些基因启动子的顺式作用元件。亚细胞定位结果表明，AdNAC6和AdNAC7蛋白主要分布于细胞质中。当利用序列突变排除miR164的影响时，AdNAC6和AdNAC7蛋白则会出现在细胞核中。这可能是因为排除miR164的影响时，AdNAC6和AdNAC7蛋白大量表达，有更多的机会形成同源或异源二聚体进而进入细胞核中。双分子荧光互补实验、酵母双杂实验和萤火虫荧光素酶互补成像实验证实了这个观点。在不同种类果实中克隆miR164的前体序列和NAC基因，并通过靶基因预测、miRNA双荧光素酶实验和进化树分析，认为miR164-NAC途径对不同种类果实的成熟调控存在保守性。