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多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)是常见的育龄期妇女的疾病。临床表现为不孕、稀发排卵或无排卵、高雄激素血症等,约50%的PCOS病人伴有肥胖。其病因复杂,发病机理不明,无明确有效的治疗及预防措施。遗传因素在该病的发病中发挥重要作用。肥胖近年来受到关注,因脂肪组织在PCOS的发病和症状的维持中起到重要的作用。人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)理论上可定向分化为人体内所有类型的细胞。近年来该研究的一个领域是建立携带有先天或者“转基因”的遗传病hESCs系。目前国内外尚无有关PCOS源性hESCs建系成功的报道。PCOS源性hESCs稳定建系后,避免了动物模型的诸多弊端,可以直接进行PCOS患者发病机理的研究；并且可以利用hESCs的无限传代及多向分化能力,可以保持其染色体稳定性,不同批次定向分化后仍可保持其一致性,方便进行基因水平的操作,具有组间对照的可比性。在体外培养过程中,避免了多次重复取患者体液或组织等痛苦。目前虽已有文献报道将hESCs成功诱导分化为脂肪细胞,但诱导分化效率普遍偏低,成为脂肪细胞相关研究的主要障碍,故提高诱导分化效率非常必要。本研究利用PCOS患者的废弃胚胎建立hESCs系并分化为脂肪细胞,进一步检测其脂代谢的功能,并和正常来源的hESCs分化的脂肪细胞进行对比,根据基因芯片技术准确、全面、快速的特点,筛选出PCOS差异表达的基因,并着重对筛选出的基因进行研究,以期从基因水平阐明PCOS病人肥胖的发病机制。本文就上述热点和难点问题从以下四个方面进行了相关研究：第一部分在非PCOS来源的胚胎干细胞建系方法成熟的基础上,进一步建立了PCOS来源人胚胎干细胞系,并对其意义进行探讨。第二部分将人胚胎干细胞定向分化为脂肪细胞,在提高分化效率方面进行了研究。第三部分在相对高效的诱导胚胎干细胞分化为脂肪细胞的基础上,应用基因芯片技术对PCOS来源和非PCOS来源的胚胎干细胞分化的脂肪细胞进行差异基因的筛选。第四部分对筛出的高表达基因NROB2在蛋白水平进行验证,研究其在胚胎干细胞分化的脂肪细胞中的分布与表达。第一部分：PCOS来源人胚胎干细胞建系方法的探讨及意义目的：建立PCOS和非PCOS来源的hESCs系,对建系方法进行探讨,并分析影响建系成功的因素。方法：1.收集郑州大学第一附属医院生殖医学中心PCOS和非PCOS来源的体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization embryo transfer, IVF-ET)和卵胞浆内单精子显微注射-胚胎移植(intracytoplasmic sperm injection, ICSI-ET)病人无移植及冷冻价值的新鲜及解冻的废弃胚胎,均经过病人知情同意后用于实验。将收集到的废弃及解冻胚胎,序贯培养到囊胚。2.分别采用免疫法、机械法、全胚接种3种不同的方法分离囊胚的内细胞团,将其种植于小鼠胚胎成纤维细胞、小儿包皮成纤维细胞和小鼠胚胎成纤维细胞和人包皮成纤维细胞按1：1混合的饲养层上,采用机械法或胶原酶法反复传代纯化,建立人胚胎干细胞系,并完成鉴定。结果：1.本实验共收集401名非PCOS患者的924枚新鲜废弃胚胎和17名PCOS患者的59个新鲜废弃胚胎,解冻25名非PCOS患者的83枚冷冻胚胎和4名PCOS患者的19枚冷冻胚胎,均序贯培养到囊胚,共获得86枚内细胞团(inner cell mass,ICM)。2.采用免疫法和机械法分离优质囊胚的ICM,种植与三种不同的饲养层上,混合饲养层可以较好的维持干细胞的生长,并得出混合饲养层细胞密度达到0.6×105/cm2即能较好的维持hESCs的生长状态。3.用机械法传代优点多,克隆生长快,形态佳,不易分化,故采用机械法传代,成功建立了17株hESCs系,其中非PCOS来源的12株,PCOS来源的5株,均完成鉴定工作。结论：1.培养系统的选择及其稳定性的维持对hESCs成功建系至关重要。2.混合饲养层的建系率显著高于单一饲养层,免疫法和机械法分离内细胞团的效率相当,机械法传代可以避免核型的变异。3. PCOS源性hESCs的建立,为研究人体发育早期PCOS的发病机理、筛选候选基因、基因修复及基因治疗等方面提供了一个良好的体外模型。第二部分：人胚胎干细胞定向分化为脂肪细胞及分化效率的研究目的：探讨罗格列酮和bFGF对人胚胎干细胞向脂肪细胞分化效率的影响,并比较PCOS来源与非PCOS来源胚胎干细胞成脂分化的能力的差异。方法：1.实验材料为第一部分PCOS患者及非PCOS患者来源的胚胎建立的人胚胎干细胞系,其中非PCOS来源的3株,PCOS来源的3株。2.采用不同浓度的罗格列酮加入基础诱导分化培养基中,分别为含0、1μmol/L、10μmol/L、100μmol/L的罗格列酮；采用不同浓度的bFGF加入基础诱导分化培养基中,分别含0、1 ng/mL、5 ng/mL、25 ng/mL的bFGF。摸索出罗格列酮和bFGF搭配的最佳浓度。3.根据在分化的不同阶段加入罗格列酮和bFGF,进行诱导方案分组。4.采用油红0染色、甘油三酯测定、MTT比色法及RT-PCR法检测PRARy-2的表达得出脂肪细胞最多的诱导分化方案,5.在摸索出最佳的诱导方案和罗格列酮、bFGF的浓度后,比较PCOS来源与非PCOS来源：hESCs定向诱导分化为脂肪细胞能力的差异。结果：1.随着分化时间的延长,诱导分化第2周时,视野中可见散在成熟脂肪细胞,细胞内出现脂滴,小脂滴聚集并出现脂滴融合现象,细胞逐渐变为圆形或椭圆形,将胞核推向细胞一侧,hESCs分化的脂肪细胞内的脂滴被油红O染色特异性染为红色。2.根据分化后脂肪细胞中甘油三酯的含量可以估算脂肪细胞的分化效率,10μmol/L罗格列酮和5ng/mL bFGF诱导分化效率均显著高于其余3组(P<0.05),在诱导的后半周期加入上述两种诱导分化因子可以得到较多的脂肪细胞。3.PCOS来源hESCs定向诱导分化为脂肪细胞能力较非PCOS组强,但是无显著统计学差异结论：1.建立hESCs向脂肪细胞体外定向分化效率较高的实验模型,即10μmol/L罗格列酮和5ng/mL bFGF联合后半周期诱导得到的脂肪细胞最多。2.分化得到的脂肪细胞不仅具有脂肪细胞的形态,还就有聚集甘油三酯的功能,并具有成熟脂肪细胞的功能,为细胞水平研究脂肪细胞的分化和代谢提供了材料。第三部分：基因芯片对PCOS来源胚胎干细胞分化的脂肪细胞差异基因的筛选目的：以脂肪细胞作为研究工具,在mRNA水平上筛选出了一些PCOS相关的分子标志物及基因,从而为探索PCOS发病的分子机制提供线索和依据,为临床诊断与治疗提供了新的途径和可能靶标。方法：1.实验材料为3株PCOS来源的hESCs系(p-hESC-1, p-hESC-2, p-hESC-3)定向分化的脂肪细胞作为实验组1、2、3；1株非PCOS来源的hESCs系(ZZU-hESC-1))定向分化的脂肪细胞作为对照组。2.应用北京博奥晶芯(?)人类全基因组寡核苷酸微阵列芯片,采用基因芯片检测与分析PCOS来源的hESCs系定向分化的脂肪细胞和非PCOS来源的hESCs系定向分化的脂肪细胞的差异基因的比较。3．对筛选出的差异基因进行Real-time PCR验证结果：1.在芯片的分析结果中,共获得PCOS和非PCOS来源hESCs分化的脂肪细胞差异表达基因153个,其中上调表达91个,下调表达62个2.差异基因分别属于多个分子功能家庭,包括DNA结合、金属离子结合、水解酶、受体激活和转移酶等等；参与多个生物过程,包括糖代谢、脂代谢、细胞信号传递及调控等等,该部分差异基因占总数的一半；还有一部分差异基因位于不同的细胞组分上；对其进行信号通路分析发现差异基因分布广泛,涉及糖、脂类代谢、凋亡、信号通路及各种疾病等等。3.应用Real-time PCR抽检部分差异表达基因,Real-time PCR结果与芯片结果在上调或下调的趋势上一致,且数据较为接近。结论：1.基因芯片是筛选PCOS相关差异基因的一种有效方法,PCOS和非PCOS来源hESCs分化的脂肪细胞在基因表达上有差异,这些差异基因很多涉及糖、脂代谢,并与甾体激素相关,进一步研究后有部分基因可作为PCOS发生发展的候选基因。2. Real-time PCR结果证实本次基因芯片筛查结果真实、可靠。第四部分：NROB2在胚胎干细胞分化的脂肪细胞中的分布与表达目的：分析探讨NROB2基因表达与PCOS之间的关系。以期为PCOS患者早期筛选和有效地治疗提供新的分子标志物,为临床治疗提供新的理论基础。方法：1.实验材料是PCOS来源的hESCs系p-hES-1和非PCOS来源的hESCs系ZZU-hES-1分别定向诱导分化的脂肪细胞。2.在分化不同阶段(0天、7天、14天、21天),行免疫细胞化学检测hESCs分化的脂肪细胞中NROB2基因的产物SHP蛋白的表达和细胞定位。3.应用Western-blotting检测脂肪细胞中SHP蛋白的表达情况。结果：1.SHP蛋白在胞浆中表达,其表达随着脂肪细胞的成熟而增加。2. Western blotting检测,结果提示p-hESC-1组分化的脂肪细胞的SHP量显著高于ZZU-hESC-1组分化的脂肪细胞。结论：1.免疫细胞化学和Western blotting的检测结果与基因芯片的结果相符,验证了SHP蛋白在PCOS来源胚胎干细胞分化的脂肪细胞中也存在高表达。2. NROB2基因可能参与PCOS的发病,并与PCOS患者的肥胖、高胰岛素血症、胰岛素抵抗及糖尿病的发生相关联。