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在漫长的进化长河中,南极鱼类演化出了一系列适应寒冷环境的策略。其中抗冻蛋白(AFP)对维持其生存是至关重要的。鱼类的AFP蛋白家族根据组成和结构差异分为不同的类型,其中III型抗冻蛋白(AFPIII)是一个由64个氨基酸残基构成的球形结构域蛋白,在南极绵鳚亚目鱼类体内丰富表达。我们实验室前期工作中发现了一个2.87 kb的cDNA克隆,ld12,它是一个由12个重复的AFPIII单体组成的多聚抗冻蛋白分子。我们进一步克隆得到了一个由9aa连接子相接的4个串联重复AFPIII单体,并将其命名为LD4。前期的研究发现将此蛋白导入到烟草中,在4℃低温下它能提高烟草的耐寒性。以往的研究表明,鱼类抗冻蛋白的作用机制是“吸附-抑制”模型。它们都能通过一个特殊的表面吸附于冰晶表面,抑制冰晶的生长。因此,传统意义上抗冻蛋白保护鱼类免受冻害的损伤是通过物理学上的与冰晶之间的相互作用,没有涉及生理学意义上的生物化学功能。而LD4在没有冰晶存在的低温状态下提高生物体耐寒性的机制还尚未可知。最近有研究发现低温刺激可使细胞形成应激颗粒,应激颗粒是细胞遭遇不利刺激时产生的一种自我保护机制。因此我们猜想LD4是否在应激颗粒形成中发挥重要的作用。我们通过将克隆得到的ld4表达载体转染到Hela(人子宫颈癌细胞)细胞系中,采用反转录PCR(RT-PCR)、Western Blot方法检测到目的基因ld4在细胞中成功表达。在对细胞进行低温胁迫处理时,通过台盼蓝染色发现10℃刺激下表达ld4基因的HeLa细胞与对照组相比存活率明显增强。进一步通过细胞免疫荧光的方法检测细胞在低温胁迫下(10℃)细胞应激颗粒的形成情况。结果表明,与对照组相比较,在低温胁迫下,表达ld4基因的HeLa细胞中应激颗粒明显减少。为了进一步揭示表达LD4细胞中应激颗粒形成减少的机制,我们检测了翻译起始因子e IF2a的磷酸化水平,它在细胞应激颗粒形成中发挥至关重要的作用。我们的研究发现,在低温胁迫下,表达ld4基因的He La细胞中e IF2a的磷酸化水平显著的降低。这表明,低温胁迫下ld4能够通过抑制翻译起始因子eIF2a的磷酸化,导致HeLa细胞中应激颗粒的形成明显降低。我们以上的研究结果表明:在低温胁迫下,ld4提高了细胞形成应激颗粒的阈值,并且促进了细胞的生长与增值。我们的研究结果为ld4基因作为鱼类耐寒育种的候选基因提供了理论依据。