论文部分内容阅读
《中华人民共和国药典》2005年版一部收载的灵芝来源于多孔菌科真菌赤芝Ganodermaludcidum(Leyss.ex Fr.)Karst.或紫芝GanodermasinenseZhao，Xu et Zhang的干燥子实体。具有补气安神，止咳平喘的功效。临床用于眩晕不眠，心悸气短，虚劳咳喘等症。三萜类化合物为灵芝主要有效成分之一，具有广泛的药理活性如抑制肿瘤、抗衰老、保肝护肝等。本研究主要目的为从赤芝中分离得到灵芝三萜酸类化学成分，并以其作为指标性成分，对灵芝的三萜类化学成分进行质量评价的研究。 （一）灵芝三萜类单体化学成分的分离、制备及鉴定:以灵芝三萜类化学成分为目标，应用硅胶、ODS、葡聚糖柱等材料对其进行了提取、分离与纯化，建立了灵芝三萜类化学成分稳定的制备工艺方法；并从中得到六种灵芝三萜酸类化学成分，应用光谱解析等方法对其结构进行了鉴定，分别为灵芝酸A、灵芝酸B、灵芝酸C、灵芝酸G、赤芝酸A和灵芝酸E，其中灵芝酸A和灵芝酸C的制备量达到300mg，其它几种化合物制备量均超过50mg，经HPLC检测，灵芝酸A等六种化学成分的纯度均达到98％以上，符合对照品规格。为灵芝质量的控制提供了科学的依据。 （二）灵芝三萜类化学成分高效薄层指纹图谱的研究:优化了2005年版《中华人民共和国药典》灵芝鉴定项下的展开条件，建立了灵芝的最佳薄层色谱条件：以自制的灵芝酸A等六种单体化合物作为对照品，在相对湿度32％的条件下，以正己烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（30:30:2:0.2）展开，展至约5cm，取出,晾干，再用正己烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（30:30:1:0.2）展开，展至约8cm，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（366nm）下检视。分别建立了紫芝与赤芝的对比薄层色谱指纹图谱；商品灵芝的薄层色谱指纹图谱；灵芝近缘属药材薄层色谱指纹图谱以及灵芝孢子油的高效薄层色谱指纹图谱。 （三）灵芝三萜类化学成分的高效液相指纹图谱研究 1．灵芝三萜类化学成分的含量测定:对赤芝中灵芝酸A等六种单体化学成分进行了系统的提取方法学考察，以确定了灵芝三萜类成分的最佳提取方法为取灵芝粗粉（过40目筛）0.5g，加氯仿100ml，超声处理30分钟，两次。 以色谱条件为Kromalsil C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流速为0.9ml·min－1，进样量：10μl，检测波长：254nm，以乙腈(A)－0.8%高氯酸(B)（A：0-10min，30-35%；10-58min,35-40%；58-60min）梯度洗脱，测定灵芝及其近缘属药材中灵芝酸A等六种单体化学成分的含量。 2．灵芝三萜类化学成分的高效液相指纹图谱研究:根据国家食品药品监督管理局《中药注射剂指纹图谱研究技术指南》（暂行）、《中药注射剂色谱指纹图谱实验技术指南》（试行）和相关文献，通过指纹图谱方法学考察，确定了最佳的洗脱体系为乙腈（A）－0.8%高氯酸（B）（A:0-10min，30-35%；10-58min，35-40%；58-60min，40-55%；60-115min,55-70%；115-140min，70-90%)。 从赤芝高效液相指纹图谱共有模式中可分离出近60个色谱峰，从中选定18个色谱峰作为可以构建灵芝三萜指纹图谱的稳定的特征峰，并将其分为2个区：主峰区（Ⅰ区）：从图谱0～60min的区域，主要包括特征峰1～14，对比灵芝总三萜酸对照品的指纹图谱可知该区主要为三萜酸类结构，主要用于辨别赤芝和紫芝；特征区（Ⅱ区）：从图谱60～140min的区域，主要有峰15～18，主要用于鉴别灵芝近缘属不同种的区域。 分别建立了紫芝与赤芝的对比高效液相色谱指纹图谱；商品灵芝的高效液相色谱指纹图谱；灵芝近缘属药材高效液相色谱指纹图谱以及灵芝孢子油的高效液相色谱指纹图谱。 （四）灵芝总三萜类成分的紫外分光光度法的检测:首次采用灵芝总三萜酸（纯度>95%）作为对照品，以10％硫酸乙醇作为显色剂，在253nm处直接测定总三萜酸的含量，从而建立了灵芝总三萜类化学成分的稳定、准确、专一的测定方法。