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研究目的:本研究以C2C12成肌细胞为研究对象,利用外源性叔丁基过氧化氢孵育制备氧化应激细胞模型,观察成肌分化进程中线粒体稳态及生物钟相关蛋白表达的动态规律,以探讨氧化应激对成肌分化进程中线粒体生物节律的调控机制。并对线粒体稳态进行干预,拟验证线粒体是否可逆向调控生物钟。研究方法:(1)外源性的叔丁基过氧化氢(t-BHP)在不同浓度梯度(0μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM、120μM)作用C2C12成肌细胞的条件摸索,MDA含量测定评价细胞氧化应激水平,从而确定造成氧化应激的t-BHP浓度。(2)外源性t-BHP调控成肌分化进程中线粒体稳态生物节律实验:C2C12成肌细胞分为control组和t-BHP treated组,加入马血清启动成肌分化,t-BHP treated组细胞在分化起始时加入100μM的t-BHP,将分化开始后的48h定义为ZT0,分别在ZT0,ZT4,ZT8,ZT12,ZT16,ZT20和ZT24收集细胞检测相关指标。Western-blotting检测Mfn2,OPA1,Drp1,COXIV,PGC-1α及Bmal1蛋白表达水平,荧光定量PCR检测MyoD mRNA表达。(3)线粒体稳态干预实验:C2C12成肌细胞分为4组:空质粒对照组、OPA1 siRNA组;DMSO对照组、Drp1抑制剂组。加入马血清启动成肌分化对C2C12成肌细胞进行分化和叔丁基过氧化氢孵育,在分化开始后的48h定义为ZT0,每4个小时进行细胞收集一次,分别为ZT0,ZT4,ZT8,ZT12,ZT16,ZT20,ZT24。实验分组:control组和t-BHPtreated组;Western-blotting检测Mfn2,OPA1,Drp1,COXIV,PGC-1α及生物钟Bmal1表达,荧光定量PCR成肌分化MyoD的表达。分化开始时,空质粒对照组加入空白干扰片段,OPA1 siRNA组加入OPA1siRNA干扰片段,DMSO对照组加入DMSO溶液、Drp1抑制剂组加入50μM的Mdivi1。分化48 h时收集细胞检测相关指标。Western-blotting检测OPA1,Drp1及Bmal1蛋白表达。荧光定量PCR检测MyoD和PGC-1α,线粒体力能学检测活性氧和膜电位。研究结果:(1)在外源性t-BHP调控成肌分化进程中线粒体生节律实验中,JTK-CYCLE算法分析结果表明,对照组(MnSOD,Mfn2,OPA1,L-OPA1,S-OPA1,Drp1,COXIV,PGC-1α,OMA1及Bmal1)蛋白表达和MyoD的基因水平表达均具有显著生物节律,MnSOD,OPA1,COXIV,PGC-1α,OMA1,S-OPA1,蛋白表达,MyoD的基因水平表达均表现为波峰值显著高于均值(p<0.05),Drp1,L-OPA1,OMA1,Drp1及Bmal1的蛋白表达均出现波谷值显著低于均值(p<0.05),MyoD的基因水平表达与MnSOD,Mfn2,OPA1,L-OPA1,S-OPA1,OMA1,Drp1,COXIV,PGC-1α及Bmal1的蛋白水平表达均出现波谷值显著低于波峰值(p<0.05)。t-BHP treated组(MyoD的基因水平表达,MnSOD,Mfn2,OPA1,L-OPA1,S-OPA1,OMA1,Drp1,COXIV,PGC-1α及Bmal1的蛋白表达)未表现显著生物节律,MyoD的基因水平表达,MnSOD,Mfn2,OPA1,L-OPA1,S-OPA1,OMA1,Drp1,COXIV,PGC-1α及Bmal1的蛋白表达表现为波峰、波谷和均值间比较无显著差异(p>0.05)。与对照组比较,t-BHP treated组(MyoD的基因水平表达,MnSOD,Mfn2,OPA1,L-OPA1,S-OPA1,OMA1,Drp1,COXIV,PGC-1α及Bmal1的蛋白表达的总表达量显著降低(p<0.05~0.01)。(2)在线粒体稳态干预实验中,与空质粒组比较,OPA1 siRNA组活性氧是显著升高(p<0.05),膜电位(p<0.05~0.01),PGC-1α,MyoD的基因水平以及蛋白Bmal1,OPA1,Drp1的蛋白表达水平表达显著降低(p<0.05)。与DMSO对照组,Drp1抑制剂组膜电位显著升高(p<0.05~0.01),MyoD的基因水平和蛋白Bmal1的水平表达并无显著变化(p>0.05),PGC-1α的基因水平和活性氧显著下降(p<0.05)。研究结论:1.C2C12细胞成肌分化进程中,线粒体稳态(生物合成、融合/分裂)和成肌分化相关因子表达呈显著生物节律。2.本研究利用外源性叔丁基过氧化氢孵育建立C2C12细胞氧化应激模型,证明氧化应激导致成肌分化进程中线粒体稳态生物节律异常或消失。3.本研究利用OPA1 siRNA和Drp1抑制剂建立C2C12细胞线粒体稳态干预模型,证明线粒体稳态障碍抑制生物钟基因表达,具体机制有待进一步研究。