论文部分内容阅读
背景和目的多发性硬化（Multiple sclerosis,MS）是常见的、主要发生于年轻患者的中枢神经系统白质炎症脱髓鞘疾病,是引神经源性膀胱的第二大病因[1]。MS患者以尿频、尿急、尿潴留等为最常见症状的膀胱功能障碍是泌尿系统工作中最常见的临床问题之一。大约有超过75%的MS患者可在病程的任何阶段出现下尿路症状[2],严重影响患者的生活质量,给患者带来沉重的心理和经济负担。目前MS患者出现尿频、尿潴留等下尿路症状相关的病理生理机制尚未清楚地阐明。支配排尿功能的相关神经细胞发生改变可能使膀胱平滑肌结构、功能出现变化,导致平滑肌收缩功能下降（Impaired detrusor contractility,IDC）等微观变化。就目前来看,临床上治疗MS所致的神经源性膀胱相关症状仍非常棘手,既往的治疗手段如抑制膀胱过度活动等药物虽然对部分患者有一定效果,但仍与预期效果相差甚远。在神经源性膀胱导致的下尿路症状的发生发展中,膀胱局部组织的纤维化及重塑过程起着重要作用。但引起膀胱组织发生重塑及纤维化的具体的分子学机制仍不甚明了,其中转化生长因子β1（Transforming growth factor-β1,TGFβ1）和结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor,CTGF）可能与此过程密切相关[3]。近年来,很多研究逐渐认识到mi RNA与多种纤维化疾病有着紧密联系,miR-133包括miR-133a和miR-133b两个成员,已经有学者发现mi R-133a与肝脏纤维化[4]和心肌纤维化[5]密切相关,但是其在MS致神经源性膀胱膀胱重塑的过程中的调控效应及调控机制知之甚少。因此,本研究拟探究miR-133介导TGFβ1/CTGF信号通路在MS致神经源性膀胱中的分子作用机制,以期寻找抵抗膀胱纤维化的新的分子作用靶点,抑制或减缓膀胱重塑进程,改善MS患者膀胱顺应性,为进一步治疗MS致神经源性膀胱提供新的治疗思路。方法1.从北京维通利华动物公司购得C57BL/6J小黑鼠30只,雌性,79周龄（1822g）,构建MS致神经源性膀胱动物模型,即EAE小鼠模型。小黑鼠共分为两组,即Blank组（10只）和模型组（20只）,并做好标记。构建EAE小鼠模型成功后根据小鼠症状轻重进行临床评分（Clinical score,CS）。2.定期称量小鼠体重并记录。模型组小鼠发病的集中时间大约是模型建立后的第1319天,此时小鼠发病为病程急性期。在建模后第49天,将Blank组所有小鼠及模型组CS评分为3分的所有小鼠使用10%水合氯醛麻醉处死。无菌条件下取出膀胱组织,置于1×PBS缓冲液内冲洗干净,称量空虚膀胱湿重并记录,然后将一半膀胱组织立即置于液氮罐中,另一半置于事先准备好的标本固定液中,所有标本做好标记,留存后续使用。3.对两组固定的小鼠膀胱组织制作石蜡切片,进行HE染色、马松染色,观察小鼠膀胱壁内平滑肌数量及形态的变化。4.分别对两组小黑鼠提取膀胱组织总RNA,采用QRT-PCR技术检测膀胱组织miR-133的表达量,观察两组差异性。5.采用免疫荧光技术、Western blot技术,分别定性、定量检测两组小黑鼠膀胱组织内TGFβ1和CTGF的表达,观察两组差异性。6.原代培养C57BL6/J小鼠的膀胱组织平滑肌细胞,鉴定完毕后,将平滑肌细胞转染miR-133类似物,检测其转染效率,从而形成miR-133过表达组,同时设置Blank组。7.分别提取Blank组、miR-133过表达组的细胞总RNA和蛋白,QRT-PCR法及免疫印迹法进一步观察TGFβ1、CTGF的表达变化,明确miR-133与CTGF基因的调控关系,进而参与膀胱壁内重塑过程,影响神经源性膀胱的发生发展。结果1.EAE模型小鼠建立成功,发病率87.9%,发病高峰期1319天,CS评分3分小鼠共13只。2.Blank组和模型组小鼠总体重无显著性差异,但模型组膀胱重量明显增多（P<0.001）,膀胱体重比率明显增大（P<0.001）。3.HE及马松染色结果显示:EAE小鼠膀胱壁内平滑肌细胞肥大伴增生,胶原纤维在固有层、细胞肌束间较Blank组明显增高。模型小鼠出现膀胱纤维化表现。4.动物水平研究结果显示:与Blank组相比,模型组小鼠膀胱内miR-133a/miR-133b表达明显下调（P<0.05）,TGFβ1、CTGF在mRNA水平及蛋白水平均表达上调（P<0.05）。5.细胞水平研究结果显示:向平滑肌细胞内转染miR-133类似物,48h后提取细胞总RNA,miR-133表达较Blank组显示明显增加（P<0.05）。进一步检测TGFβ1、CTGF分子,结果显示:与Blank组相比,miR-133过表达组在mRNA水平及蛋白水平TGFβ1表达无明显差异（P>0.05）,但CTGF表达显著下调（P<0.05）。结论1.MS致神经源性膀胱小鼠模型膀胱组织内存在膀胱结构重塑现象,TGFβ1、CTGF分子可能发挥重要促进作用。2.miR-133可能靶向调节CTGF基因,阻止膀胱重塑进一步发展,可为MS患者神经源性膀胱的治疗提供一个新的思路和靶点。