论文部分内容阅读
肺高压（pulmonary hypertension,PH）是肺循环疾病,是由多种病因和发病机制引起的一种临床、病理生理综合征,其主要特点是肺血管阻力进行性增加。在慢性低氧肺高压（chronic hypoxia-induced pulmonary hypertension,CHPH）模型中,机体内氧化与还原系统会处于失衡状态,导致体内或细胞内活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）的蓄积,促使氧化应激的发生,进而引起氧化损伤。细胞内ROS的增加会引起血管平滑肌的钙离子稳态失衡,使血管收缩和平滑肌细胞增殖,而ROS的主要来源是NADPH氧化酶（NADPH oxidase,NOX）。瞬时受体电位（transient receptor potential,TRP）超家族中的TRPM2作为氧化应激传感器,介导了氧化应激引起的细胞内Ca2+浓度升高,并参与多种细胞的生理及病理过程。已有研究表明,在体循环动脉和血管平滑肌细胞上,5-羟色胺（5-HT）可激活NOX产生ROS,促进血管收缩,细胞增殖以及心脏肥大。本研究通过建立CHPH模型,与正常（control,CON）组比较5-HT诱发大鼠肺动脉平滑肌细胞（pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs）的钙反应,运用NOX非特异性和特异性抑制剂、以及TRPM2抑制剂,观察其抑制效果并确定哪种NOX亚型起主要作用,进一步验证是否参与TRPM2介导作用,进而为PH发病机制的研究提供新的理论依据。目的:观察CON及CHPH大鼠PASMCs上5-HT诱发的钙反应情况,并使用不同NOX抑制剂作用及TRPM2抑制剂观察其对钙反应的影响,确定PH发病机制过程中的主要NOX亚型,并明确是否由TRPM2介导。方法:SD大鼠饲养箱氧分压为9.5%10.5%,建立慢性低氧（chronic hypoxia,CH）诱导的慢性肺高压大鼠模型。测定以下指标:（1）右心室收缩压（RVSP）;（2）右心重量指数（RVMI）;（3）酶解法培养原代PASMCs;（4）荧光检测细胞内钙离子浓度:在CON及CH大鼠PASMCs上,运用不同NOX抑制剂以及TRPM2抑制剂后观察其对5-HT诱发的钙反应,明确是否由NOX-TRPM2介导。结果:1.CHPH模型大鼠与CON组相比,mRVSP及对应的RVMI均显著增高,提示模型制备成功。2.NOX抑制剂对5-HT诱导的CON大鼠PASMCs钙反应的影响。NOX非特异性抑制剂（APO,30μM）可降低5-HT诱导的CON大鼠PASMCs钙释放及钙内流,提示NOX参与该反应过程;三种特异性NOX抑制作用后,5-HT诱导的PASMCs钙内流均降低,其内流速率也降低,其中NOX1/4抑制剂（GKT137831,10μM）与NOX1抑制剂（ML171,10μM）的抑制作用较为明显;对于5-HT诱导的PASMCs钙释放,NOX2抑制剂（gp91 ds-tat,10μM）的抑制作用不明显,而GKT137831与ML171均能显著抑制。提示NOX1、NOX2和NOX4亚型均参与5-HT诱导的钙反应过程,其中,NOX1及NOX4亚型在该反应中起着重要作用。3.NOX抑制剂对5-HT诱导的CH大鼠PASMCs钙反应的影响。CHPH模型大鼠与CON组相比,静息钙增高,5-HT诱导的PASMCs钙释放及钙内流均升高,钙内流速率也加快,提示在CHPH中,PASMCs对5-HT呈钙高反应性;在CH组中,GKT137831与ML171均可降低5-HT诱导的PASMCs钙反应,其抑制作用与在CON组中基本一致,提示NOX1,4亚型在CH模型大鼠PASMCs钙高反应过程中起着主要作用。4.TRPM2抑制剂对5-HT诱导的CON大鼠PASMCs钙反应的影响。TRPM2抑制剂（ACA,10μM）可降低5-HT诱导的CON大鼠PASMCs钙释放及钙内流,同时也能降低其内流速率,提示TRPM2参与该反应过程;TRPM2通道可能参与了5-HT诱导的CON大鼠PASMCs钙反应过程。结论:1.在CON大鼠中,NOX参与5-HT诱导的PASMCs钙反应;且NOX1,4亚型在该反应中起着重要作用。2.在CHPH模型大鼠中,NOX1,NOX4参与了5-HT诱导的PASMCs的钙高反应。3.TRPM2通道可能参与了5-HT诱导的钙反应性过程。4.本研究结果可为PH发病机制的阐明及PH的防治提供新思路。