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本文主要从以下几方面进行了论述: 第一部分 目的: 1.通过优化反应体系,建立SYBR GreenⅠ染料real-time PCR检测Survivin基因的方法。 2.验证二次导数最大值(SDM)法确定Ct值在实时定量荧光PCR中的应用价值。 方法: 1.根据PCR产物荧光强度、循环阈值(Ct值)、标准曲线斜率、相关系数和熔解曲线优化反应体系中各组分的量及反应条件,并对引物二聚体消除策略和Ct值获取方式进行评价。 2.根据SDM法确定Ct值不受荧光曲线基线影响的特性,建立一种不需核酸抽提步骤而直接利用血清快速定量检测血清中乙肝DNA的实时荧光PCR方法,用于验证其效能。由于蛋白质,胆红素、血红蛋白和甘油三酯等不可避免地存在于血清中,可能对检测产生干扰,因此按EP7-P方案对其进行了抗干扰评价。 结果: 1.SYBR GreenⅠ实时定量荧光PCR体系扩增Survivin的最佳组成和条件是:Taq酶2.5U/100μl、MgCl22mmol/L、引物浓度0.2μmol/L和退火温度58℃;在PCR循环延伸结束后设置一个低于特异产物Tm值2℃的荧光读取温度,能有效消除引物二聚体对定量检测的影响。研究建立的SYBR GreenⅠ染料实时定量PCR检测Survivin基因剂量方法的灵敏度为10拷贝/μl,线性范围101~104拷贝/μl(r=0.9997),批内变异系数(CV)1.13％~1.91%,批间CV3.31%~4.50%。 2.在实时荧光PCR检测系统采用SDM法确定Ct值,不仅能克服了主观因素所致重复性差的问题,同时还能在多种基质效应和荧光干扰物存在的情况下保证定量检测结果的可靠性,应被当作实时荧光定量PCR确定Ct值的首选方法。 结论: 1.优化后的SYBR GreenⅠreal-time PCR具有方便、经济、灵敏度较高和重复好等特性,适合于做Survivin基因剂量分析。 2.SDM法确定Ct值法明显优于手工阈值法,适合于实时荧光PCR检测。 第二部分 目的: 1.研究Survivin及其选择性剪接变异体在胃癌中的表达及意义。 2.探讨胃癌Survivin基因扩增与表达以及临床病理参数之间的关系。 3.建立限制性内切酶依赖的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法,检测胃癌组织Survivin外显子1去甲基化状态,研究其与Survivin mRNA表达以及临床病理参数之间的关系。 4.探讨Survivin基因启动子区域-31G→C多态性与胃癌发生及Survivin mRNA表达的关系。 方法: 1.建立SYBR GreenⅠ实时荧光RT-PCR方法,结合免疫组织化学技术,对Survivin各种剪接变异体在胃癌及癌旁组织中的表达情况进行检测,同时还对Survivin各种剪接变异体表达水平和临床病理资料作相关性分析。 2.建立一种实时荧光定量PCR检测Survivin基因的方法,Survivin基因和内参β2-MG基因的绝对含量通过参考DNA的标准曲线获得,以目的基因拷贝与看家基因拷贝数比值计算目的基因的相对拷贝数,以肿瘤组织DNA相对拷贝数与正常组织DNA相对拷贝数比值>2.0判断为肿瘤目的基因扩增。 3.25例胃癌及与其配对的正常胃组织DNA经甲基化敏感性限制性内切酶HpaⅡ和MspⅠ处理后用SYBR GreenⅠ实时荧光PCR对Survivin外显子1进行检测,Survivin mRNA的表达水平采用实时荧光定量PCR的方法进行检测。 4.采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术(PCR-RFLP)检测Survivin基因多态性,同时用实时荧光RT-PCR对肿瘤组织的Survivin mRNA进行定量检测。 结果: 1.癌组织和癌旁组织均表达Survivin,并且得到免疫组织化学的证实;Survivin-2B主要表达于癌旁组织,而Survivin-△EX3则主要在癌组织中被检出;Survivin-3B偶见于癌组织和癌旁组织中;Survivin-2a在癌组织和癌旁组织中的阳性率为100%,但并不伴随着Survivin在癌组织中升高。经相关分析,Survivin-2a与总Survivin高度正相关(rs=0.4178,P=0.0018),而与Survivin-△EX3高度负相关(rs=-0.4506,P=0.0007),提示Survivin-2a可能作为非凋亡抑制因子,在肿瘤组织中对抗凋亡抑制因子。 2.胃癌组织中Survivin基因的扩增率为13.9%(6/43),扩增倍数一般在2-10不等,发生扩增的6例均高表达Survivin mRNA;肿块≥5cm的胃癌组织Survivin基因扩增率为33.3%,明显高于肿块<5cm的胃癌组织(6.5%的扩增率),具有显著差异(P﹤0.05);胃癌组织中Survivin基因扩增与患者年龄、病理类型、淋巴转移和临床分期无相关性。 3.Survivin外显子1去甲基化率在胃癌组织和癌旁组织分别为96.0%(24/25)和20.0%(5/25)(2=29.639,p<0.001)。在25例胃癌组织中有22例(88.0%)发生Survivin mRNA过表达,并且表达与去甲基化呈正相关(rs=0.5528,P=0.00416)。没有发现去甲基化与年龄、性别、肿瘤大小、病理分级、临床分期和转移与否等病理参数之间存在统计学上的相关性(P>0.05)。 4.胃癌Survivin-31位C/C基因型频率显著高于对照组(基因频率0.396对0.119,2=18.89,P<0.005),-31C等位基因频率也显著高于对照组(等位基因频率0.594对0.328,2=7.498,P<0.005)。胃癌组织高表达Survivin mRNA,但未发现Survivin-31基因型与Survivin mRNA表达之间的相关性。 结论: 1.Survivin不同变体表达之间的平衡关系可能对肿瘤的发生和发展起重要作用,其检测对肿瘤早期诊断和肿瘤性质判断有一定价值。 2.Survivin基因扩增与胃癌的发生有一定关系,对胃癌的早期诊断和预后判断可能具有重要的临床意义。 3.去甲基化的Survivin外显子1增强Survivin mRNA的表达,可能是胃癌发生和发展过程中的早期事件。 4.Survivin基因启动子-31C/C基因型和-31C等位基因与胃癌相关,可能是肿瘤发生的易感因素之一。