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帕金森病(PD)是一种神经退行性疾病,其主要临床特征是严重影响患者的运动功能。随着我国逐渐进入老龄化时代,PD越来越受到家庭与社会的关注[1,2]。PD的主要病理学特点是中脑SNc区DA神经元发生变性和死亡,导致多巴胺的释放减少,但DA神经元变性死亡的具体机制尚不明确。研究发现,约5%-10%的PD例明确是和遗传因素相关的,这部分病例与特定的基因改变有关[3],而大多数PD病例是散发的,其确切的发病原因还不明确。流行病学研究已经证明特定的环境因素暴露(如神经毒剂)和PD的发病之间有确定的联系[4],表明部分神经毒剂会导致或促进PD发病。现在有一个被广泛认同的观点是:遗传与环境因素共同作用于细胞,破坏细胞稳态并导致了氧化应激,继而造成了DA神经元的死亡,这其中一个关键的靶点是线粒体。越来越多的实验数据表明,家族遗传性PD中一些基因的突变可能是通过影响线粒体功能而产生致病效果,同样,一些毒剂也是通过这个途径导致PD发病。但是目前对线粒体功能紊乱、氧化应激级联反应、蛋白聚集和诱发神经元死亡的关键分子及信号通路缺乏进一步的了解,妨碍了PD的诊断治疗,特别是早期发现疾病。神经影像学、基因组学和系统生物学的方法在反映疾病的发展和变化上仍存在较多的限制和障碍[5]。在发病机制深入研究基础上,探索一种可靠、敏感的PD生物学标记物成为目前急需解决的关键问题。肌细胞增强因子2(MEF2)最早在骨骼肌的相关研究中被发现,后来被证实在越来越多的方面发挥自己特有的作用。MEF2D已被证实与神经元存活密切相关[6,7]。本课题组前期研究发现,转录因子MEF2D对于DA神经元的存活起关键性作用[6],不同的细胞应激能够通过相应的信号通路调节MEF2D的功能,对神经元的存活产生影响。MEF2D在DA神经元线粒体中表达,并参与呼吸链复合体I活性的调节[7]。在线粒体中,MEF2D特异性调节线粒体NADH脱氢酶6(ND6)基因的转录表达。ND6是唯一由线粒体轻链编码的蛋白质,在呼吸链复合体I组装过程中发挥着必不可少的作用;降低线粒体MEF2D表达水平会明显抑制呼吸链复合体I的功能,导致细胞内过氧化物水平升高,诱发神经元死亡[8],而大量表达线粒体靶向MEF2D时可以保护神经毒素诱发的DA神经元死亡。现有研究结果提示:线粒体MEF2D对与线粒体功能具有重要调控作用,MEF2D与其氧化修饰水平对于把金森并的发病过程具有重要影响。本研究采用小鼠MPTP-PD亚急性模型,探索在PD模型中,DA神经元线粒体MEF2D表达水平以及氧化修饰水平的动态变化;研究MEF2D、ND6以及线粒体功能变化与DA神经元损伤的关系;通过与其他转录因子对比,初步分析线粒体MEF2D及其氧化修饰水平作为PD生物学标记物的可行性。实验一:MPTP-PD模型中动态检测线粒体MEF2D水平变化方法(1)建立小鼠MPTP-PD亚急性模型,实验动物随机分为4组:Con(对照)组,D1(给药第1天)组,D3(给药第3天)组,D5(给药第5天)组,D1、D3和D5组为实验组。实验组小鼠按30mg/kg剂量腹腔注射MPTP,注射时间为上午9点,每天一次,连续5天,对照组于同时间注射同等剂量0.9%生理盐水。(2)在给药的当天下午3点处死D1组小鼠,第3天同时间点处死D3组小鼠,第5天同时间点处死Con组和D5组小鼠,分别收取样本。(3)使用免疫荧光染色法动态检测小鼠中脑DA神经元水平变化情况。(4)分离细胞质、细胞核以及线粒体,使用免疫印迹法检测分离纯化效果。(5)使用免疫印迹法动态检测小鼠中脑DA神经元细胞核和线粒体MEF2D水平变化情况。(6)分离小鼠的小脑,皮层,纹状体,使用免疫印迹法分别检测各脑区线粒体MEF2D水平变化情况。结果(1)免疫荧光结果显示,在给药的第1、3、5天中,与对照组相比,小鼠黑质致密部DA神经元水平出现不同程度显著下降,在给药第5天几乎消失殆尽,证明小鼠MPTP-PD亚急性模型建立成功。(2)免疫印迹结果显示细胞质,细胞核以及线粒体分离效果良好,相互之间没有混杂或污染,达到实验要求。(3)在给药的1、3、5天中,细胞核MEF2D水平没有出现明显变化,而同区域的线粒体MEF2D在给药的第一天即出现明显下降(P<0.05),并在第3天和第5天出现显著下降(P<0.01)。(4)小鼠小脑,皮层,纹状体线粒体MEF2D水平在给药的1、3、5天中没有出现明显变化,只有黑质区线粒体MEF2D水平与对照组相比明显降低(P<0.05)。结论(1)在PD模型中,小鼠黑质区线粒体MEF2D水平变化与同时间点中脑DA神经元损失水平相一致,能够较好地反映DA神经元水平变化情况。(2)小鼠黑质区线粒体MEF2D水平变化并不是由非特异性应激反应所引起,其变化水平与DA神经元受损程度密切相关。实验二:MPTP-PD模型中动态观测核转录因子Nurr1和线粒体转录因子TFAM的水平变化方法(1)同实验一建立小鼠MPTP-PD亚急性模型,随机分为4组:Con组,D1组,D3组,D5组。(2)使用免疫印迹法检测小鼠中脑DA神经元Nurr1和TFAM动态水平变化。结果(1)在PD模型中,小鼠中脑多巴胺能神经元细胞核转录因子Nurr1在给药的第1、3、5天中没有出现明显的变化,同区域线粒体转录因子TFAM在给药的第1天和第3天没有明显变化,第5天时出现明显下降(P<0.05)。结论(1)在PD模型中,细胞核转录因子Nurr1和线粒体转录因子TFAM这两种重要的存活相关转录因子对于多巴胺能神经元的水平变化都不够敏感,线粒体MEF2D相比于Nurr1和TFAM,对于多巴胺能神经元的损伤更加敏感,能够更好地反映多巴胺能神经元的受损程度。实验三:观察线粒体MEF2D氧化修饰水平与DA神经元线粒体功能变化的相关性方法(1)同实验一建立小鼠MPTP-PD亚急性模型,随机分为4组:Con组,D1组,D3组,D5组。(2)使用Oxy Blot技术检测线粒体MEF2D氧化修饰水平动态变化。(3)使用q RT-PCR技术检测ND6 m RNA水平的动态变化。(4)通过测定在450nm下NADH的氧化速率检测呼吸链复合体I活性的动态变化。结果(1)在PD模型中,与对照组相比,中脑DA神经元线粒体MEF2D氧化修饰水平自给药第3天开始出现明显升高,在给药的1、3、5天中呈逐渐升高趋势。(2)同区域ND6 m RNA水平在给药第3天明显下降(P<0.05),在第5天显著下降(P<0.01)。(3)同区域Complex I活性在第3天和第5天时出现显著下降(P<0.01)。结论(1)在PD模型中,小鼠中脑多巴胺能神经元线粒体MEF2D氧化修饰水平与对照组相比明显升高,同时伴有ND6转录水平的明显下降以及呼吸链复合体I活性显著降低,明确了线粒体MEF2D氧化修饰水平与ND6转录水平以及线粒体功能变化的一致性。