【摘 要】
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叶片是植物的主要光合器官,也是土壤表层以上环境因子的主要调节者。叶片的形态发生和分化是个高度灵活的过程,从而导致叶形的多样性。而叶片变异是植物叶片多样性方面最突出的一面。番茄（Solanum lycopersium）是全世界最重要的园艺作物之一,也是研究植物生长发育的模式植物。Aux/IAA基因家族成员涉及到植物生长发育的多个方面,Sl IAA9基因是Aux/IAA基因家族成员之一。前人研究结果表
【基金项目】
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国家自然科学基金（31471888和31772317）; 中央高校基础研究基金（项目编号:2662015PY224）
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叶片是植物的主要光合器官,也是土壤表层以上环境因子的主要调节者。叶片的形态发生和分化是个高度灵活的过程,从而导致叶形的多样性。而叶片变异是植物叶片多样性方面最突出的一面。番茄（Solanum lycopersium）是全世界最重要的园艺作物之一,也是研究植物生长发育的模式植物。Aux/IAA基因家族成员涉及到植物生长发育的多个方面,Sl IAA9基因是Aux/IAA基因家族成员之一。前人研究结果表明Sl IAA9-RNAi转基因番茄株系表现为果实单性结实和单叶等表型。entire突变体是Sl IAA9基因CDS区域第626bp处单碱基C缺失形成的突变体,该突变体也表现为单叶。前人研究结果表明Aux/IAAs蛋白和ARFs蛋白互作具有不同的生物学功能。本研究通过酵母双杂交筛选出与Sl IAA9互作的候选Sl ARFs蛋白,通过病毒诱导基因沉默（VIGS）技术初步分析其在调控叶片发育方面的功能。主要研究结果如下:1、酵母双杂交、双分子荧光互补试验和pull-down试验结果表明,Sl IAA9与Sl ARF6A、Sl ARF8A、Sl ARF8B及Sl ARF24蛋白互作。2、Sl ARFs基因家族成员在复叶材料AC及单叶材料entire突变体中的表达量分析,结果表明entire突变体改变了多个Sl ARFs基因的表达模式。3、为初步筛选候选Sl ARF6A、Sl ARF8A、Sl ARF8B及Sl ARF24基因的功能,利用VIGS技术分别沉默这4个候选基因中的1个、2个、3个及4个基因。发现只有同时沉默掉这4个候选基因时,entire突变体的叶形由单叶转变为一定程度的复叶,出现了一定程度的表型恢复。因此,我们推测,同时沉默Sl ARF6A、Sl ARF8A、Sl ARF8B及Sl ARF24基因时,可以使entire突变体出现一定程度的表型恢复。此外,与entire突变体相比,该材料中的IAA含量显著增加。4、为进一步验证我们的结论,我们设计了一个同时表达4个sg RN As的CRISPR/Cas9载体,同时敲除Sl ARF6A、Sl ARF8A、Sl ARF8B和Sl ARF24基因。在转基因后代中成功得到了具有表型恢复的突变体植株CR4-3和CR4-4,其叶片表现为复叶。并分析了这两棵植株的基因型,结果表明,T3位点（Sl ARF6A）序列没有变化,T1位点（Sl ARF8B）、T2位点（Sl ARF8A）和T4位点（Sl ARF24）均出现了不同程度碱基的插入和缺失,结果表明,CR4-3和CR4-4植株同时敲除了Sl ARF8A、Sl ARF8B和Sl ARF24基因,为3突材料,可以使entire突变体出现一定程度的表型恢复。5、CR4-3和CR4-4植株不仅叶形转变为一定程度的复叶,而且果实表现为单性结实率显著增加。IAA含量测定的结果表明,CR4-3和CR4-4植株叶片中的IAA含量与受体entire突变体叶片中的IAA含量相比,显著增加,呈极显著差异水平,结果表明,CR4-3和CR4-4植株叶片功能的恢复受到了生长素的调控。6、酵母单杂交和双荧光素酶测定试验结果表明,Sl ARF6A和Sl ARF24可以特异性的与Sl PIN1的启动子结合。我们猜测候选Sl ARFs蛋白可能通过调控Sl PIN1基因的表达,进而调控叶片发育。
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