【摘 要】
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脊椎动物的骨骼肌大部分来源于轴旁中胚层体节,先后经历增生和肥大过程,出生前骨骼肌细胞的数目经增殖分化途径大致已经恒定,出生后主要是肌纤维的肥大增粗以及肌肉卫星细胞响应刺激重新进入细胞周期修复受损肌纤维。骨骼肌发育是一个极其复杂的过程,受到包括生肌调节因子（MRF）和肌细胞增强因子2（MEF2）家族在内的转录因子的精确调控。研究表明非编码RNA也广泛参与骨骼肌的发育,其中涉及微小RNA（miRNA）
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（31772574）； 山东省农业良种工程项目（项目编号:2020LZGC014）；
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脊椎动物的骨骼肌大部分来源于轴旁中胚层体节,先后经历增生和肥大过程,出生前骨骼肌细胞的数目经增殖分化途径大致已经恒定,出生后主要是肌纤维的肥大增粗以及肌肉卫星细胞响应刺激重新进入细胞周期修复受损肌纤维。骨骼肌发育是一个极其复杂的过程,受到包括生肌调节因子（MRF）和肌细胞增强因子2（MEF2）家族在内的转录因子的精确调控。研究表明非编码RNA也广泛参与骨骼肌的发育,其中涉及微小RNA（miRNA）及长链非编码RNA（lncRNA）的相关研究较为深入。近年来环状RNA（circRNA）作为一类环状闭合的新型非编码RNA因其高稳定性的特征引起高度关注。非编码RNA调控骨骼肌发育的具体分子机制目前知之甚少,涉及转录、转录后及翻译调控,其中研究最为广泛的是竞争性内源RNA（ceRNA）,即非编码RNA通过自身miRNA反应元件（MRE）与miRNA的靶分子竞争性地结合miRNA,从而间接调控miRNA靶分子的机制。本论文基于ceRNA理论,通过分析处理实验室积累的秦川牛两个不同发育时期（胎牛90天,成年牛24月龄）骨骼肌circRNA测序数据,构建秦川牛骨骼肌circRNA-miRNA-mRNA共表达网络,用于挖掘秦川牛骨骼肌发育中重要的circRNA并进行后续的鉴定及功能机制研究。主要研究结果如下:1、牛骨骼肌circRNA-miRNA-mRNA网络构建及功能富集分析为了筛选通过ceRNA途径发挥功能的circRNA,利用生物信息学手段分析了秦川牛两个不同发育时期（胎牛90天,成年牛24月龄）骨骼肌circRNA高通量测序数据,成功构建了circRNA-miRNA-mRNA三元互作网络。随后,对该网络进行了GO和KEGG分析,用以注释共表达circRNA潜在的功能与涉及的通路,并且对共表达的circRNA进行了生物学鉴定及组织表达谱分析。结果显示三元互作网络由17个circRNA、18个miRNA以及462个mRNA组成。功能富集分析表明,这些circRNA主要参与细胞发育过程,暗示其在牛骨骼肌发育过程中可能发挥着重要作用。通过实验手段总共鉴定出6个circRNA:circRNA47、circRNA126、circRNA962、circRNA2121、circRNA4394和circRNA4490。对鉴定出来的这6个circRNA在秦川牛两个不同发育时期进行了组织表达谱分析,发现这些circRNA在胎牛骨骼肌组织中高表达,暗示它们可能调控早期骨骼肌发育。2、circHUWE1调控牛肌原代细胞增殖分化的ceRNA机制研究从构建好的三元互作网络中筛选出circHUWE1-miR-29b-AKT3信号轴,通过一系列的实验探究circHUWE1-miR-29b-AKT3调控牛肌原代细胞发育的具体过程。首先通过生物学手段鉴定circHUWE1（circRNA47）是circRNA,核质分离实验显示circHUWE1主要定位于细胞质,暗示其参与转录后调控。通过构建circHUWE1过表达载体及干扰片段转染牛肌原代细胞分别进行功能获得性及缺失性实验,利用CCK-8、Ed U、流式细胞术、q RT-PCR及WB手段检测细胞增殖、凋亡和分化表型。结果显示circHUWE1促进牛肌原代细胞增殖,并抑制细胞凋亡和分化。接着,借助生物信息学手段、双荧光素酶报告基因测定法和AGO2RNA免疫沉淀（RIP）方法来验证circHUWE1、miR-29b和AKT3之间的互作关系,结果表明circHUWE1可以通过竞争性结合miR-29b解除其对AKT3的抑制,从而最终激活AKT信号通路调控牛肌原代细胞的增殖凋亡及分化。3、circSVIL通过抑制STAT1磷酸化来调节牛肌原代细胞的发育从牛骨骼肌circRNA-miRNA-mRNA共表达网络中筛选出circSVIL（circRNA126）并成功进行生物学鉴定,核质分离及FISH结果显示circSVIL在细胞核和细胞质中都有表达。借助CCK-8、Ed U、流式细胞术、q RT-PCR及WB实验方法,证实了circSVIL能够促进牛肌原代细胞增殖,抑制细胞凋亡。然而,后续机制探究显示circSVIL并不通过ceRNA途径发挥调控功能。生物信息学预测到circSVIL有STAT1转录因子结合位点,通过进一步的细胞核质分离、RIP及挽救实验,证实了circSVIL可以通过与STAT1相互作用抑制STAT1磷酸化,抑制STAT1核易位影响STAT1的下游信号级联,从而促进肌原代细胞增殖并抑制细胞凋亡。本研究通过利用秦川牛两个不同发育时期骨骼肌circRNA高通量测序数据构建了circRNA-miRNA-mRNA三元网络模型,筛选出具有潜在调控骨骼肌发育的circHUWE1及circSVIL,并且在牛肌原代细胞水平上进行了一系列功能机制研究,阐明了circHUWE1及circSVIL调控牛肌原代细胞发育的功能及作用机制,这些发现提供了牛骨骼肌发育的新的调控途径,也为后续肉牛育种提供了潜在的候选分子。
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