九节龙皂苷-Ⅰ对脑胶质瘤细胞侵袭迁移的作用及机制研究

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目的:探讨九节龙全草提取物九节龙皂苷-Ⅰ(Ardipusilloside-I,ADS-I)对体外培养人脑胶质瘤U87细胞在侵袭、迁移等生物学特征的影响及其可能的作用机制。方法:体外无菌培养人脑胶质瘤U87细胞,以不同浓度(0、2、4、8、16、32μM)的ADS-I作用于U87细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)实验观察ADS-I在不同作用时间(24、48、72h)对U87细胞增殖的影响;采用Transwell小室侵袭迁移模型,于小室底部铺上含50mg L-1的基底胶模拟人体内基底金属膜,给予不同浓度的ADS-I(1、3、5μM)作用于体外培养的U87细胞,24h后观察细胞侵袭能力的改变;于六孔板中采用细胞划痕实验观察不同浓度的ADS-I(1、3、5μM)在不同时间点(0、6、24h)对体外培养的U87细胞迁移能力的影响;采用明胶酶谱法,通过含有1g L-1明胶的8%丙烯酰胺凝胶中观察不同浓度的ADS-I(1、3、5μM)对U87细胞所分泌的基质金属蛋白酶(Matrix-metalloproteinase,MMPs)活性的影响;采用细胞免疫化学的方法,通过相应的抗体抗原结合,观察不同浓度的ADS-I(1、3、5μM)作用U87细胞后,细胞内MMPs在相应抗体下的阳性反应。结果:从MTT实验中观察到U87细胞在一定浓度的ADS-I作用下被抑制生长,并且这种抑制作用随着作用时间及药物浓度的增加而增加,ADS-I作用24h、48h、72h后的U87细胞的半数抑制浓度(50%inhibitingconcentration,IC50)分别为8.02±0.16μM、6.63±0.10μM、5.41±0.05μM。由于ADS-I在24小时即表现出对U87细胞明显的抑制作用,受时间和经费的限制,在后续实验中,本研究选择ADS-I的作用时间点为24h,作用浓度为1、3、5μM;Transwell实验、细胞划痕实验观察到经过ADS I作用后,与对照组相比,U87细胞迁移和侵袭能力明显降低。在Transwell实验中,浓度为3、5μM ADS-I作用U87细胞24h后,抑制细胞侵袭的能力达到45%以上,而低浓度组不明显;细胞划痕实验中药物作用细胞随着时间延长,剂量越大的组显示出越强烈的抑制迁移作用,在24小时,对照组迁移率为55.44%,1μM迁移率为50.02%,3μM为25.97%,5μM为12.99%;明胶酶谱实验中观察到与对照组相比,经过ADS-I作用后,3、5μM的ADS-I处理24小时后U87细胞所分泌的MMP-2明显降低,分别下降至73.22%和61.53%,而1μM ADS-I处理24小时后对U87分泌的MMP-2活性的抑制作用不明显。在细胞免疫化学中,显示经过DAB显色实验及显色程度对比,得出对照组与低剂量组染色呈深棕黄色(+++),3、5μM的ADS-I处理24小时后的细胞分别呈棕黄色(++)和浅棕黄色(+),且IOD值随着药物浓度的增大而值越低,表明此蛋白的阳性率也随之降低,可以说明ADS-I作用于人脑胶质瘤U87细胞内MMP-2活性明显降低,随着药物浓度的增加,抑制U87细胞内MMP-2的作用越强。结论:一定浓度的ADS-I可体外抑制人脑胶质瘤U87细胞迁移和侵袭能力,其机制可能与ADS-I降低细胞基底金属酶的活性相关。
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