论文部分内容阅读
目的： α2-Heremans-Schmid糖蛋白(α2-Heremans-Schmid-glycoprotein，AHSG)基因于肝脏特异性表达，其编码合成的产物又称胎球蛋白A(fetuin-A)，是一种分泌型糖蛋白，对骨代谢及矿化起重要调节作用:一方面AHSG促进钙磷等矿物质在骨胶原纤维网内矿化，另一方面抑制心血管等其它组织的异位矿化。因此，AHSG对骨质疏松症的发生其保护作用，AHSG是骨质疏松症的重要易感基因。 雌激素撤退是女性绝经后骨质疏松症发病的重要原因之一，然而其具体机制尚不清楚。有研究表明不同AHSG基因型的妇女，腰椎及股骨颈的骨密度(bonemineral density，BMD)也明显不同。绝经后妇女血浆AHSG水平下降，行雌激素治疗后AHSG水平又回升。因此，雌激素很可能通过调节AHSG基因表达而影响AHSG水平。而雌激素对AHSG基因的调节作用以及相关机制还没有被阐明。 本研究中，我们通过动物模型及培养细胞验证雌激素对AHSG基因的转录调控作用，利用荧光素酶报告基因载体及其它分子生物学实验具体分析雌激素调节AHSG基因转录的可能机制，为揭示AHSG基因对骨质疏松症，尤其是绝经后骨质疏松的发病提供新的理论依据。 材料与方法： 1、利用卵巢切除的(oophorectomized，OVX) Wistar骨质疏松大鼠建立绝经后骨质疏松模型，并设立假手术对照组。 2、采集大鼠血、尿，解剖分离肝脏及股骨。骨质疏松参数选择及测定如下:全自动生化分析仪测定尿钙、血钙及血磷等离子;三点弯曲试验法检测股骨的机械力学;双能X线骨密度仪测定股骨干的矿物质含量。 3、ELISA检测大鼠血清Ahsg水平。提取大鼠肝脏中RNA和蛋白质，Real-timePCR和Western blot检测Ahsg的表达。 4、培养人肝癌细胞系HepG2细胞，转染ERα表达载体，施加100 nM E2刺激，或与雌激素抑制剂100 nM ICI182780、转录抑制剂2.5μg/ml放线菌素D共同孵育。应用ELISA，Real-time PCR和Western blot检测AHSG的表达。 5、扩增-1554/+53 AHSG启动子区域，构建荧光素酶报告基因载体，并进行系列截短，与ERα载体共转染HepG2细胞，施加E2刺激，检测荧光素酶活性，寻找雌激素敏感的AHSG启动子区域。 6、提取的HepG2细胞核蛋白，电泳迁移实验(electrophoresis mobility shiftassay，EMSA)鉴定-1488/-1482 AP-1反应元件。染色质免疫沉淀(Chromatinimmunoprecipitation，CHIP)，re-ChIP,和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)分析ERα和c-Jun/c-Fos在-1488/-1482 AP-1结合位点处的相互作用。 7、以特异性的MAPK抑制剂10μM PD98059预处理E2/ERα作用的HepG2细胞，或转染MEK1激活MAPK信号通路，Western blot检测c-Jun、c-Fos、及AHSG的表达，评估MAPK途径在雌激素诱导AP-1和AHSG表达的过程中的作用。 结果： 1、OVX大鼠血钙、血磷及尿钙浓度增加、骨矿物质含量及机械强度明显下降，上述参数均提示OVX大鼠呈现绝经后骨质疏松表型。与假手术对照组相比，血清AHSG水平明显下降，肝脏AHSG mRNA及蛋白的表达也明显降低。 2、与对照组相比，用E2/ERα处理的HepG2细胞AHSGmRNA升高了1.6倍，且能够被ICI182，780或放线菌素D所抑制。同时其AHSG蛋白表达也明显升高，且能够被ICI182，780所抑制。 3、AHSG启动子-荧光素酶报告基因检测提示不同截短的AHSG启动子活性不同，-1500pAHSG-LUC载体对E2/ERα的反应最明显。进一步截短丢失-1488/-1482AP-1反应元件后，失去了对E2/ERα的反应性。 4、EMSA发现HepG2细胞的核提取物与野生型-1488/-1482AP-1寡核苷酸探针形成特异性结合带，E2/ERα增强了结合带信号，且该结合带可被冷探针抑制，加入AP-1抗体形成超阻滞(supershif)，突变型探针没有结合带。 5、ChIP表明HepG2细胞的核提取物分别与c-Jun，c-Fos和ERα抗体免疫沉淀后，PCR扩增AHSG-1488/-1482 AP-1反应元件的启动子区域呈阳性。c-Jun，c-Fos抗体免疫复合物再次与ERα抗体进行免疫沉淀的re-ChIP试验，仍有特异性扩增。Real-time PCR定量发现E2/ERα处理增加了c-Jun，c-Fos和ERα与AHSG启动子区的结合。 6、Co-IP发现HepG2细胞的核提取物与c-Jun抗体免疫沉淀后，能够与ERα抗体Western blot得出阳性结合带，反之亦然，c-Jun与ERα的结合可以被E2/ERα加强。 7、E2/ERα处理增加了HepG2细胞AP-1的表达丰度。MAPK信号通路特异性抑制剂PD98059处理阻断了E2/ERα对AP-1及AHSG表达的上调作用，转染特异性MEK1激活MAPK通路后，加强了E2/ERα对AP-1及AHSG的表达上调作用。 结论： 1、AHSG的转录与表达在OVX骨质疏松大鼠及HepG2细胞中都存在雌激素反应性。 2、雌激素通过ERα与c-Jun/c-Fos形成转录复合物，结合于AHSG启动子-1488/-1482 AP-1反应元件，实现对AHSG的转录激活作用。 3、MAPK信号通路参与了雌激素诱导的c-Jun/c-Fos表达丰度，进而增强ERα/c-Jun/c-Fos复合物与AHSG启动子的结合亲和力，增强AHSG的转录活性。