活血养阴益气法对血管生成的影响

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目的:通过观察复方血栓通胶囊在不同浓度剂量下对人脐内皮细胞增殖、迁移实验、CAM微血管生成、大鼠动脉环微血管生成与VEGF转基因斑马鱼血管生成的影响,探讨活血养阴益气法在细胞、组织层面和整体动物水平对血管生成的影响。  方法:①取第2代HUVEC放入5个不同浓度的复方血栓通组培养基培养,用酶标仪测各组的吸光度,统计各组细胞的存活数量。  ②参考Burk的方法加以改进[1],分空白对照组、PTK787溶液组和低、中、高复方血栓通胶囊组,培养后,倒置显微镜记录结果,拍照后计算划线间细胞最近距离。  ③实验方法参照huang的方法改进[2],将血管环包埋孵育,加入低、中、高浓度的复方血栓通胶囊溶液、10μg·ml-1PTK787溶液做对照组,分5组,7d取出,倒置显微镜下观察动脉环附近新血管的生成情况;随机选择3个区域拍照并运用Image Pro Plus软件计算微血管所覆盖的面积。  ④把发育优良的6日的鸡胚胎随机分为5组,分为复方血栓通胶囊低、中、高剂量的组、空白对照组、手术开窗组。把CAM剪下,拍照后用Photoshop选定照片上的一定面积(300×300像素),运用Image pro-plus计算3个面积内的平均血管面积。  ⑤斑马鱼胚胎于24hpf后取出,每组10胚胎,分为空白对照组PTK787组、低、中、高浓度复方血栓剂量组,将鱼体放于载玻片上,在荧光显微镜下观察记录斑马鱼发育情况和节间血管数量,对节间血管进行计数并拍照;照片利用Image Pro Plus软件计算节间血管覆盖的荧光面积(IPP-area),在倒置显微镜下观察节间血流数量,并对节间结构进行拍照。  结果:①复方血栓通胶囊组在100μg·ml-1、200μg·ml-1、400μg·ml-1浓度中细胞数量减少,与空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05),且在400μg·ml-1浓度组差异显著(P<0.01)。  ②空白对照组细胞迁移划线变窄,PTK787组、复方血栓通胶囊中、高剂量组划线变宽,且与空白对照组比较差异具有统计学意义(p<0.05)。  ③空白对照组长出微血管呈放射状、团片状,PTK组表现出微血管无生长或者生长稀少,分布零散;复方血栓通中剂量组的微血管生成明显减少,复方血栓通高剂量组见少量微血管出现,且与空白对照组比较PTK787组、复方血栓通胶囊中、高剂量组差异具有统计学意义(p<0.05),血栓通高剂量组和PTK787组差异更加明显(p<0.01)。  ④血管面积计数显示复方血栓通胶囊高剂量组600μg/个与手术组、空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。  ⑤空白对照组斑马鱼体节间血管生成良好,荧光强;PTK787组斑马鱼,体节间血管明显缺失、断裂,血管计数明显减少,荧光强度减弱,在倒置显微镜下观察无节间血流出现。与空白对照组比较,PTK787组斑马鱼节间血流计数和节间荧光计数与空白对照组比较具有显著性差异(p<0.01),与空白对照组比较,复方血栓通胶囊高剂量组节间血管结构紊乱,节间血流计数统计学差异明显(p<0.01)。  结论:1.复方血栓通胶囊对内皮细胞的增殖与迁移有明显的抑制作用,对大鼠动脉环的微血管生成、CAM微血管生成、转基因斑马鱼血管的生成均具有一定抑制作用,且存在一定的药物浓度依赖性。  2.活血养阴益气法对血管的生成有一定抑制作用。
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