海洋真菌多糖YCP免疫检测方法及生产工艺的研究

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多糖是一类重要的生物大分子,自从日本学者开展多糖研究以来,从一些真菌中提取生物活性物质,尤其是真菌多糖成了人们的研究热点。实验证明真菌多糖在致病性、免疫刺激等方面具有重要作用。   YCP是从海洋真菌YS4108的菌丝中提取纯化获得的一种大分子水溶性胞内多糖,研究表明YCP具有显著的体内抗肿瘤活性,可显著抑制小鼠S180和Heps等移植性肿瘤以及Lgwis肺癌的生长,同时对动物细胞的免疫和体液免疫功能均有明显的调节作用,其硫酸酯化产物能引入新的抗氧化活性,为解决药源问题,本所对产生菌YS4108的培养条件优化方面进行了相关研究。随着进一步开发研究,多糖YCP有望创制成拥有我国自主知识产权的抗肿瘤Ⅰ类新药。   深入研究的同时发现,在高产菌株筛选、培养条件优化以及从基因水平上研究多糖生物合成途径等工作中,需要对多糖YCP进行分析与含量测定。目前常用的多糖含量测定方法,如蒽酮比色法和硫酸-苯酚法在应用特异性、灵敏性方面受到了局限,为此本研究在获得了高亲和力的YCP-McAb的基础上,以CDAP为交联剂制备YCP-BSA偶联产物,利用该偶联产物为包被抗原YCP为竞争抗原,两者与定量的YCP-McAb反应,建立检测YCP的间接竞争ELISA测定法。最佳抗原包被浓度为2.5 mg/L,最佳单抗工作浓度为1:5000,HRP-抗小鼠IgG工作浓度为1:4000。得到回归方程y=-0.1718x+1.9638,r2=0.9916和标准曲线,可测量最适范围为1~1000μg/L,最小检测量为0.1μg/L,批内和批间变异系数分别低于5.45%和8.37%。建立了酶联免疫吸附法(ELISA)以检测海洋真菌多糖YS4108发酵过程中抗肿瘤多糖(YCP)的含量。考察了加样回收率同时,用该方法完成了工业培养基的优化,此外体外合成试验中多糖的测定为分析多糖的生物合成途径奠定了理论基础。   在课题组前人研究工作的基础上,对原有的发酵工艺进行了改良:有机碳源改用马铃薯淀粉,在分离纯化过程中排除了其他杂多糖的干扰;根据菌种特性,在种子罐发酵时添加搅拌,增大发酵时的剪切力,使得菌丝更加分散且增大了溶氧,有利于菌体与多糖的积累。三次中试发酵过程的重复性较好,能达到10 g/L的菌丝得率和1‰的多糖收率,且利用改良后的发酵工艺使得发酵周期缩短了近20 h,更加符合大规模生产需求。同时对YCP大规模发酵过程中基质的消耗、菌体的生长、产物的形成等各参数的变化情况进行监测,以便对发酵过程进行较好的分析,从而总结出中试生产上的一系列规律,为工业化控制奠定基础。
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