论文部分内容阅读
岩藻聚糖硫酸酯作为褐藻所固有的细胞间多糖,是一种水溶性的杂聚多糖,又被称为褐藻糖胶。研究表明,岩藻聚糖硫酸酯通过诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期和抑制细胞迁移等多条途径抑制肿瘤细胞增殖,但是其作用靶点研究较少。因此,为解决上述抑制肿瘤的机制以及作用靶点的问题,本课题通过设计系列实验首先从细胞凋亡、细胞周期和细胞迁移等方面对岩藻聚糖硫酸酯抑制肿瘤细胞增殖活性的机制进行了初步地探究,接着从蛋白水平和基因水平进一步证明了岩藻聚糖硫酸酯抑制肿瘤的通路靶点以及信号通路。具体包括以下几个方面:(1)岩藻聚糖硫酸酯抑制肿瘤细胞增殖活性的研究通过MTT法探究多种来源的岩藻聚糖硫酸酯对不同细胞增殖活性的影响,研究结果表明800 μg/mL时实验室提取的岩藻聚糖硫酸酯对HT-29细胞增殖活性的抑制作用最明显,抑制率约为60%;探究岩藻聚糖硫酸酯对细胞迁移、周期以及凋亡等方面的影响时,结果表明800 μg/mL时,岩藻聚糖硫酸酯诱导细胞凋亡的效果最为显著,约有80%的细胞处于凋亡晚期:阻滞细胞G0/G1期次之,阻滞率约为50%;抑制细胞迁移的效果并不显著,抑制率仅有30%,这表明岩藻聚糖硫酸酯主要通过诱导细胞凋亡来抑制细胞的增殖活性。(2)岩藻聚糖硫酸酯诱导HT-29细胞凋亡途径的研究为探究死亡受体途径与线粒体途径在HT-29细胞凋亡中的作用,由JC-1染色、RT-PCR以及Western blot结果可知,加入岩藻聚糖硫酸酯后800 μg/mL时红绿荧光比降低,由此可知线粒体膜的完整性被破坏;随着岩藻聚糖硫酸酯浓度的增大,DR4的表达量不断提高,而DR4被沉默后细胞存活率显著提升:除此之外,JNK不断被激活为P-JNK,800μg/mL时,p-JNK/JNK 比值由2.9提高至5.2左右。由此可知,岩藻聚糖硫酸酯能够由JNK信号通路介导通过死亡受体途径与线粒体途径诱导HT-29细胞凋亡。(3)HT-29细胞凋亡过程中死亡受体途径与线粒体途径关系的探究通过Western blot法探究两者在细胞凋亡过程中的关系时由结果可知,抑制死亡受体途径后800 μg/mL时细胞存活率由40%提高至约为75%;此外,细胞色素C表达量差异减小,细胞色素C与对照组中表达量比值由1.43降至1.32。抑制线粒体途径或同时抑制两者后细胞存活率均由40%提高至约为80%;细胞色素C与对照组中表达量比值由1.43分别降至1.15与1.13,即抑制线粒体途径或同时抑制两者后细胞色素C表达量比值与细胞存活率相近,且均与抑制死亡受体途径不同,因此通过细胞存活率与细胞色素C表达量差异可知线粒体途径处于DR4途径的下游。综上所述,自提的岩藻聚糖硫酸酯能够通过死亡受体途径与线粒体途径诱导HT-29细胞凋亡来抑制其增殖活性,且其中线粒体途径处于DR4途径的下游;除此之外,JNK信号通路在凋亡过程中发挥着十分重要的作用。因此,本课题对岩藻聚糖硫酸酯的抑制肿瘤细胞增殖活性的机制及其作用受体的初步探究不仅能够为岩藻聚糖硫酸酯在保健品和药品中的应用上奠定理论基础,而且能够为海带资源的高值化开发提供研究支持。