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[目的]构建TLR4基因沉默siRNA慢病毒载体并鉴定；培养H22肝癌细胞后用慢病毒载体进行转染,实时荧光定量PCR和Western blot检测肝癌细胞目的基因的表达。采用MTT法检测H122细胞增殖情况。从而研究H22肝癌细胞生物学特性的改变。[方法](一)TLR4基因沉默siRNA慢病毒载体构建：应用siRNA设计软件按照siRNA设计原则设计靶序列,分别与u6载体连接,构建重组慢病毒载体,(二)转染感受态细胞,提取质粒,酶切鉴定,测序,再进行慢病毒颗粒的包装。(三)培养H122肝癌细胞并感染慢病毒,收集感染肝癌细胞进行实时荧光定量PCR分析,筛选出具有较高效的干扰率的设计序列。(四)West-blotting检测：选取RNAi组、空载体转染组及对照组细胞,分别提取总蛋白,经电泳分离,显影,灰度值计算比较等步骤,检测TLR4、MyD88及NF-kB的表达并比较各组差异。(五)将RNAi组和对照组细胞按一定浓度铺板,设置空白孔,连续3天使用MTT法测量其OD值,最终利用各组每天平均OD减去空白孔OD所得值绘制生产曲线,并比较其差异。[结果](一)通过shRNA设计软件设计TLR4基因沉默shRNA序列,并插入慢病毒载体中,构建了3条TLR4基因沉默慢病毒序列和1条含空载体序列的对照慢病毒载体,将重组慢病毒干扰载体进行质粒小量提取,然后酶切、电泳、测序,将二者逐一比对,可发现设计基因序列与测序序列完全相符,慢病毒载体构建成功。(二)采用不同滴度的慢病毒颗粒分别转染H22肝癌细胞,可观察到不同滴度转染后细胞的生长情况,MOI=10时通过光学显微镜观察,H22肝癌细胞形态良好,荧光显微镜下观察,存在大量荧光,即荧光率较高。(三)通过实时荧光定量PCR检测3条shRNA分别感染H22肝癌细胞所表达的mRNA水平,可检测到shRNA#1具有最高的干扰效率。(四)经West-biotting检测提示各蛋白各组表达量具有差异,差异有统计学意义,且RNAi组表达最少。(五)RNAi组和对照组增殖有统计学差异,且RNAi组增殖减弱。[结论](一)通过TLR4基因与u6慢病毒载体连接并包装生产成功构建了TLR4基因沉默siRNA慢病毒载体。(二)测定了最适MOI值,并感染H22肝癌细胞。(三)经实时荧光定量PCR测定显示shRNA#1能高效沉默TLR4基因。(四)siRNA’慢病毒载体能干扰肝癌细胞TLR4基因使TLR4、MyD88及NF-kB表达降低。(五)沉默肝癌细胞的TLR4基因后,可以抑制其增殖。