【摘 要】
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苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因特别是CryⅠAb/Ac基因是目前应用最广的抗虫转基因植物的抗虫基因。抗虫转基因植物研究及其产业化的飞速发展对其检测方法提出了更高的要求。基于
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苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因特别是CryⅠAb/Ac基因是目前应用最广的抗虫转基因植物的抗虫基因。抗虫转基因植物研究及其产业化的飞速发展对其检测方法提出了更高的要求。基于特异抗体的蛋白水平的检测方法是目前抗虫转基因植物的主要检测方法之一。本研究在制备苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白CryⅠAb/Ac特异抗体的基础上,建立了快速、简便、准确的抗虫转基因植物蛋白水平的检测方法。研究结果如下:1、本研究构建了苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白CryⅠAb/Ac的表达载体pET30-Ac、pET30-Ab,经过表达、纯化,制备了抗虫转基因植物蛋白检测的标准物质。2、为制备CryⅠAb/Ac的特异性抗体,本研究利用等电点法结合胶回收纯化法,制备了高纯度的苏云金芽孢杆菌晶体杀虫蛋白CryⅠAb/Ac的免疫原,经SDS-PAGE电泳分析显示只有一条带,说明获得的分子量约为130KD的杀虫晶体蛋白达到了电泳纯,为制备特异性抗体提供了条件保障。3、用制备的免疫原免疫新西兰大白兔,获得了识别苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白CryⅠAb/Ac的高质量兔抗体,并且该抗体也能识别重组的CryⅠAb/Ac。抗体用硫酸铵沉淀、protein G亲和层析法进行了纯化,纯化后的抗体的效价达到1:25600。4、用制备的免疫原免疫产蛋鸡,获得了识别杀虫蛋白CryⅠAb/Ac的卵黄抗体,并且该抗体也能识别重组的CryⅠAb/Ac。经水稀释-硫酸铵沉淀法提取,嗜硫亲和层析纯化后,抗体的效价达到1:3200。5、利用兔抗体作为包被抗体,卵黄抗体作为检测抗体,成功建立起了检测CryⅠAb/Ac杀虫蛋白的Sandwich ELISA,可以在4h内完成检测,检测灵敏度达到了6.25ng/mL。6、用胶体金包被兔抗体,成功建立起了检测CryⅠAb/Ac杀虫蛋白的胶体金免疫层析检测方法,可在10min内完成检测,检测灵敏度达到了12.5ng/mL。
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