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第一部分Aurora-A参与人肝癌细胞放射抵抗的形成
背景和目的：
放射抵抗的产生是导致原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma)放疗疗效不佳或失败的主要原因，但其机制仍不完全清楚。在前期研究中，我们已经证实Aurora-AmRNA的表达在HCC细胞或组织中明显上调，并且Aurora-A促进HCC细胞恶性表型的形成。然而，Aurora-A在HCC放射抵抗中的作用尚不清楚，未有研究报道其与HCC形成放射抵抗是否相关，尚需分析研究。本文重点对Aurora-A与肝癌形成放射抵抗是否相关进行研究，同时还对Aurora-A参与HCC放射抵抗性形成的机制展开研究，为肝癌放射抵抗提供理论支撑，为提高原发性肝癌放疗敏感性提供新的方法。
方法：
1、用剂量递增的方法(2、4、6、8、10Gy)照射肝癌亲本细胞HepG2和SMMC-7721，用8个月时间建立表现出放疗抵抗性的肝癌细胞株HepG2-R以及SMMC-7721-R，利用放射后克隆形成实验检测放射抵抗株是否成功建立；利用流式细胞技术(flow cytometry)检测肝癌亲本株和肝癌放射抵抗细胞株凋亡变化。
2、采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)及免疫印迹(Western blot assays)对肝癌亲本细胞株中Aurora-A表达水平进行检测，同时对肝癌放射抵抗细胞株中Aurora-A表达水平进行检测；
3、在Aurora-A的基础之上，完成过表达慢病毒载体以及RNA干扰载体的有效构建，此后进行病毒包装以及滴度测定，对肝癌亲本株以及肝癌放射抵抗株进行感染，完成相应的稳定筛选，这样就可以获得稳定过表达的Aurora-A肝癌细胞系：HepG2/Lv-Auro和SMMC-7721/Lv-Auro；以及干扰Aurora-A表达的肝癌细胞系：HepG2-R/Lv-shAuro和SMMC-7721/Lv-shAuro。利用qRT-PCR及Westernblot检测各组细胞系中Aurora-A表达水平，对胞内Aurora-A表达水平有无人为调控进行确定。接下来实施克隆形成实验以及MTT实验，基于此检测上调Aurora-A的表达对肝癌亲本细胞株放射敏感性的影响，下调Aurora-A的表达对肝癌放射抵抗细胞株放射敏感性的影响；利用流式细胞技术检测上调Aurora-A的表达对肝癌亲本细胞株凋亡的影响，下调Aurora-A的表达对肝癌放射抵抗细胞株凋亡的影响。
4、将稳定转染的HepG2-R/shAuro、HepG2/Auro以及对照组细胞在小鼠皮下进行接种，完成皮下移植瘤模型的有效构建，接种七天后，随机各分为两组，8Gy射线照射，观察肿瘤体积生长变化。绘制肿瘤体积生长曲线、测量肿瘤体积大小，来检测过表达Aurora-A对肝癌亲本细胞移植瘤生长速度的影响，下调Aurora-A的表达对肝癌放射抵抗细胞移植瘤生长速度的影响。利用Westernblot检测放疗后HepG2-R/shAuro、HepG2/Auro及其对照组瘤体组织中Aurora-A的表达水平；利用HE及免疫组化检测放疗后HepG2-R/shAuro、HepG2/Auro及其对照组瘤体组织中PCNA的表达；利用TUNEL法检测放疗后HepG2-R/shAuro、HepG2/Auro及其对照组瘤体组织中细胞凋亡变化。
结果：
1、随着照射剂量的增加，肝癌放射抵抗细胞株放射后克隆形成能力明显高于肝癌亲本细胞株(p＜0.05，p＜0.01)，证实建立的两株放射抵抗细胞明确具有放射抵抗性。
2、qRT-PCR和Westernblot分析证实，与肝癌亲本细胞株相比，放射抵抗细胞株中Aurora-A的mRNA及蛋白水平明显上调，差异有统计学意义(p＜0.01)。
3、qRT-PCR和Westernblot分析证实HepG2/Lv-Auro和SMMC-7721/Lv-Auro细胞系中Aurora-AmRNA及蛋白表达明显均高于对照组(p＜0.01)、HepG2-R/Lv-shAuro、SMMC-7721-R/Lv-shAuro细胞系中Aurora-AmRNA及蛋白表达明显均低于对照组(p＜0.01)。4Gy剂量照射后，与HepG2-R/Lv-shcontrol或SMMC-7721-R/Lv-shcontrol相比，HepG2-R/Lv-shAuro或SMMC-7721-R/Lv-shAuro细胞集落形成能力明显减弱(p＜0.05)；MTT实验显示，降低Aurora-A表达，增强HepG2-R和SMMC-7721-R放射敏感性(p＜0.05,p＜0.01)；而过表达Aurora-A，降低HepG2和SMMC-7721的放射敏感性(p＜0.05,p＜0.01)。4Gy剂量照射后，流式细胞技术显示，降低Aurora-A表达，增强HepG2-R和SMMC-7721-R细胞凋亡率(p＜0.01)，而过表达Aurora-A，降低HepG2和SMMC-7721-R的细胞凋亡率(p＜0.01)。
4、一次性8Gy放射线处理后，肿瘤生长曲线显示HepG2-R/shAuro组肿瘤体积生长速度明显慢于对照组(p＜0.01)，而HepG2/Auro组平均肿瘤体积明显快于对照组(p＜0.01)。处死小鼠后，测量肿瘤体积，结果显示，HepG2-R/shAuro组平均肿瘤体积明显小于对照组(p＜0.01)，而HepG2/Auro组平均肿瘤体积明显大于对照组(p＜0.01)。Westernblot检测肿瘤组织中Aurora-A蛋白表达水平，放疗后，与对照组相比，HepG2-R/shAuro组Aurora-A蛋白表达水平明显降低(p＜0.01)，而HepG2/Auro组中Aurora-A蛋白表达水平较对照组明显升高(p＜0.01)。免疫组化结果显示，放疗后，与对照组相比，HepG2-R/shAuro组PCNA阳性细胞数明显减少(p＜0.01)，而HepG2/Auro组PCNA阳性细胞数较对照组明显增加(p＜0.05)。TUNEL法分析肿瘤组织的凋亡水平，放疗后的结果显示，下调Aurora-A表达后，HepG2-R/shAuro组的凋亡几率明显高于对照组(p＜0.05)，而过表达Aurora-A后，HepG2/Auro组的凋亡几率明显低于对照组(p＜0.05)。
第二部分Aurora-A促进人肝癌细胞形成放射抵抗性的相关机制研究
背景和目的：
经研究证实，激活NF-κB信号传导通路在肿瘤产生放射抵抗中起重要作用。未激活的NF-κB在胞质内与其生理抑制因子IκBα相结合，不发挥转录功能，当细胞受到外界刺激时，复合体被激活，磷酸化IκBα并介导其降解，NF-κB得以入核并发挥转录活性功能，IκBα对NF-κB转录活性起负向调控作用。我们前期的研究表明Aurora-A诱导IκBα磷酸化，从而介导IκBα的降解和缺失，后导致NF-κB靶基因转录的激活。因此，我们假设Aurora-A可能通过诱导NF-κB活化来促进HCC产生放射抵抗性。本部分研究主要分析Aurora-A是否通过激活NF-κB来调节HCC形成放射抵抗性。
方法：
1、Westernblot检测IκBα在HCC亲本细胞株及放射抵抗细胞株细胞质和细胞核中的表达，同时检测p65蛋白(NF-κB启动因子)在HCC亲本细胞株及放射抵抗细胞株中的表达。用NF-κB依赖性荧光素酶报告载体质粒(2×NF-κB-Luc)转染亲本和放射抵抗HCC细胞株。Westernblot确定Aurora-A表达对HCC细胞中IκBα和p65蛋白表达的影响。
2、参照第一部分，构建针对Aurora-A的过表达慢病毒载体和RNA干扰载体，得到稳定过表达及低表达Aurora-A肝癌亲本细胞系及肝癌放射抵抗细胞系，用NF-κB依赖性荧光素酶报告载体质粒转染，并测定荧光素酶活性。
3、Westernblot检测调控Aurora-A表达对NF-kB下游凋亡相关蛋白(Bcl-2，Mcl-1，PARP和caspase-3)表达的影响。
结果：
1、Westernblot检测显示，无论在细胞核内还是细胞质内，放射抵抗细胞株HepG2-R、SMMC-7721-R中的IκBα表达水平明显低于肝癌亲本细胞株HepG2、SMMC-7721(p＜0.01)。
2、Westernblot检测结果显示，放射抵抗细胞株HepG2-R、SMMC-7721-R中的p65蛋白表达水平明显高于肝癌亲本细胞株HepG2、SMMC-7721(p＜0.05，p＜0.01)。
3、荧光素酶活性实验显示，NF-κB在HepG2-R、SMMC-7721-R中的活性明显高于肝癌亲本细胞株HepG2、SMMC-7721(p＜0.01)。
4、Westernblot检测结果显示，IκBα在下调Aurora-A表达的放射抵抗HCC株HepG2-R/Lv-shAuro、和SMMC-7721-R/Lv-shAuro中的表达水平较对照组明显升高，而p65蛋白表达水平在下调Aurora-A表达的放射抵抗HCC株HepG2-R/Lv-shAuro、和SMMC-7721-R/Lv-shAuro中的表达水平较对照组明显降低；IκBα在过表达Aurora-A的亲本HCC株HepG2/Lv-Auro、和SMMC-7721/Lv-Auro中的表达水平较对照组明显降低，而p65蛋白表达水平在过表达Aurora-A表达的亲本HCC株HepG2/Lv-Auro、和SMMC-7721/Lv-Auro中的表达水平较对照组明显升高。
5、荧光素酶活性实验显示，NF-κB在下调Aurora-A表达的放射抵抗HCC细胞株HepG2-R/Lv-shAuro、SMMC-7721-R/Lv-shAuro中的活性明显低于肝癌亲本细胞株HepG2-R/Lv-shcontrol、SMMC-7721-R/Lv-shcontrol(p＜0.01)；NF-κB在过表达Aurora-A的亲本HCC细胞株HepG2/Lv-Auro、SMMC-7721/Lv-Auro中的活性明显高于对照组细胞株HepG2/Lv-control、SMMC-7721/Lv-control(p＜0.01)。
6、下调Aurora-A表达后，HepG2-R/Lv-shAuro、SMMC-7721-R/Lv-shAuro中的Bcl-2和Mcl-1蛋白表达水平较对照组明显下降，而PARP和caspase-3表达水平明显升高；Aurora-A过表达后，HepG2/Lv-Auro、SMMC-7721/Lv-Auro中的Bcl-2和Mcl-1表达水平较对照组明显升高，而PARP和caspase-3表达水平明显下降。
结论：
1、我们建立了放射抵抗HCC细胞系(HepG2-R和SMMC-7721-R)。
2、Aurora-A在放射抵抗HCC细胞中显著上调。
3、下调Aurora-A通过增强放射诱导的细胞凋亡显著增加放射抵抗HCC细胞的放射敏感性，而Aurora-A的过表达在其亲本HCC细胞中诱导相反的作用。4、Aurora-A通过抑制核IκBα蛋白的表达、促进P65蛋白表达，从而增强NF-κB活性，促进NF-κB途径下游效应分子的表达，包括上调凋亡抑制蛋白凋亡Bcl-2和Mcl-1的表达，下调凋亡促进蛋白PARP和caspase-3的表达，最终抑制凋亡，增强放射抵抗性，降低肝癌细胞放射敏感性。我们的研究结果首次证明Aurora-A对HCC的放射抵抗至关重要，并且靶向该分子将是HCC放射增敏的潜在策略。
背景和目的：
放射抵抗的产生是导致原发性肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma)放疗疗效不佳或失败的主要原因，但其机制仍不完全清楚。在前期研究中，我们已经证实Aurora-AmRNA的表达在HCC细胞或组织中明显上调，并且Aurora-A促进HCC细胞恶性表型的形成。然而，Aurora-A在HCC放射抵抗中的作用尚不清楚，未有研究报道其与HCC形成放射抵抗是否相关，尚需分析研究。本文重点对Aurora-A与肝癌形成放射抵抗是否相关进行研究，同时还对Aurora-A参与HCC放射抵抗性形成的机制展开研究，为肝癌放射抵抗提供理论支撑，为提高原发性肝癌放疗敏感性提供新的方法。
方法：
1、用剂量递增的方法(2、4、6、8、10Gy)照射肝癌亲本细胞HepG2和SMMC-7721，用8个月时间建立表现出放疗抵抗性的肝癌细胞株HepG2-R以及SMMC-7721-R，利用放射后克隆形成实验检测放射抵抗株是否成功建立；利用流式细胞技术(flow cytometry)检测肝癌亲本株和肝癌放射抵抗细胞株凋亡变化。
2、采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)及免疫印迹(Western blot assays)对肝癌亲本细胞株中Aurora-A表达水平进行检测，同时对肝癌放射抵抗细胞株中Aurora-A表达水平进行检测；
3、在Aurora-A的基础之上，完成过表达慢病毒载体以及RNA干扰载体的有效构建，此后进行病毒包装以及滴度测定，对肝癌亲本株以及肝癌放射抵抗株进行感染，完成相应的稳定筛选，这样就可以获得稳定过表达的Aurora-A肝癌细胞系：HepG2/Lv-Auro和SMMC-7721/Lv-Auro；以及干扰Aurora-A表达的肝癌细胞系：HepG2-R/Lv-shAuro和SMMC-7721/Lv-shAuro。利用qRT-PCR及Westernblot检测各组细胞系中Aurora-A表达水平，对胞内Aurora-A表达水平有无人为调控进行确定。接下来实施克隆形成实验以及MTT实验，基于此检测上调Aurora-A的表达对肝癌亲本细胞株放射敏感性的影响，下调Aurora-A的表达对肝癌放射抵抗细胞株放射敏感性的影响；利用流式细胞技术检测上调Aurora-A的表达对肝癌亲本细胞株凋亡的影响，下调Aurora-A的表达对肝癌放射抵抗细胞株凋亡的影响。
4、将稳定转染的HepG2-R/shAuro、HepG2/Auro以及对照组细胞在小鼠皮下进行接种，完成皮下移植瘤模型的有效构建，接种七天后，随机各分为两组，8Gy射线照射，观察肿瘤体积生长变化。绘制肿瘤体积生长曲线、测量肿瘤体积大小，来检测过表达Aurora-A对肝癌亲本细胞移植瘤生长速度的影响，下调Aurora-A的表达对肝癌放射抵抗细胞移植瘤生长速度的影响。利用Westernblot检测放疗后HepG2-R/shAuro、HepG2/Auro及其对照组瘤体组织中Aurora-A的表达水平；利用HE及免疫组化检测放疗后HepG2-R/shAuro、HepG2/Auro及其对照组瘤体组织中PCNA的表达；利用TUNEL法检测放疗后HepG2-R/shAuro、HepG2/Auro及其对照组瘤体组织中细胞凋亡变化。
结果：
1、随着照射剂量的增加，肝癌放射抵抗细胞株放射后克隆形成能力明显高于肝癌亲本细胞株(p＜0.05，p＜0.01)，证实建立的两株放射抵抗细胞明确具有放射抵抗性。
2、qRT-PCR和Westernblot分析证实，与肝癌亲本细胞株相比，放射抵抗细胞株中Aurora-A的mRNA及蛋白水平明显上调，差异有统计学意义(p＜0.01)。
3、qRT-PCR和Westernblot分析证实HepG2/Lv-Auro和SMMC-7721/Lv-Auro细胞系中Aurora-AmRNA及蛋白表达明显均高于对照组(p＜0.01)、HepG2-R/Lv-shAuro、SMMC-7721-R/Lv-shAuro细胞系中Aurora-AmRNA及蛋白表达明显均低于对照组(p＜0.01)。4Gy剂量照射后，与HepG2-R/Lv-shcontrol或SMMC-7721-R/Lv-shcontrol相比，HepG2-R/Lv-shAuro或SMMC-7721-R/Lv-shAuro细胞集落形成能力明显减弱(p＜0.05)；MTT实验显示，降低Aurora-A表达，增强HepG2-R和SMMC-7721-R放射敏感性(p＜0.05,p＜0.01)；而过表达Aurora-A，降低HepG2和SMMC-7721的放射敏感性(p＜0.05,p＜0.01)。4Gy剂量照射后，流式细胞技术显示，降低Aurora-A表达，增强HepG2-R和SMMC-7721-R细胞凋亡率(p＜0.01)，而过表达Aurora-A，降低HepG2和SMMC-7721-R的细胞凋亡率(p＜0.01)。
4、一次性8Gy放射线处理后，肿瘤生长曲线显示HepG2-R/shAuro组肿瘤体积生长速度明显慢于对照组(p＜0.01)，而HepG2/Auro组平均肿瘤体积明显快于对照组(p＜0.01)。处死小鼠后，测量肿瘤体积，结果显示，HepG2-R/shAuro组平均肿瘤体积明显小于对照组(p＜0.01)，而HepG2/Auro组平均肿瘤体积明显大于对照组(p＜0.01)。Westernblot检测肿瘤组织中Aurora-A蛋白表达水平，放疗后，与对照组相比，HepG2-R/shAuro组Aurora-A蛋白表达水平明显降低(p＜0.01)，而HepG2/Auro组中Aurora-A蛋白表达水平较对照组明显升高(p＜0.01)。免疫组化结果显示，放疗后，与对照组相比，HepG2-R/shAuro组PCNA阳性细胞数明显减少(p＜0.01)，而HepG2/Auro组PCNA阳性细胞数较对照组明显增加(p＜0.05)。TUNEL法分析肿瘤组织的凋亡水平，放疗后的结果显示，下调Aurora-A表达后，HepG2-R/shAuro组的凋亡几率明显高于对照组(p＜0.05)，而过表达Aurora-A后，HepG2/Auro组的凋亡几率明显低于对照组(p＜0.05)。
第二部分Aurora-A促进人肝癌细胞形成放射抵抗性的相关机制研究
背景和目的：
经研究证实，激活NF-κB信号传导通路在肿瘤产生放射抵抗中起重要作用。未激活的NF-κB在胞质内与其生理抑制因子IκBα相结合，不发挥转录功能，当细胞受到外界刺激时，复合体被激活，磷酸化IκBα并介导其降解，NF-κB得以入核并发挥转录活性功能，IκBα对NF-κB转录活性起负向调控作用。我们前期的研究表明Aurora-A诱导IκBα磷酸化，从而介导IκBα的降解和缺失，后导致NF-κB靶基因转录的激活。因此，我们假设Aurora-A可能通过诱导NF-κB活化来促进HCC产生放射抵抗性。本部分研究主要分析Aurora-A是否通过激活NF-κB来调节HCC形成放射抵抗性。
方法：
1、Westernblot检测IκBα在HCC亲本细胞株及放射抵抗细胞株细胞质和细胞核中的表达，同时检测p65蛋白(NF-κB启动因子)在HCC亲本细胞株及放射抵抗细胞株中的表达。用NF-κB依赖性荧光素酶报告载体质粒(2×NF-κB-Luc)转染亲本和放射抵抗HCC细胞株。Westernblot确定Aurora-A表达对HCC细胞中IκBα和p65蛋白表达的影响。
2、参照第一部分，构建针对Aurora-A的过表达慢病毒载体和RNA干扰载体，得到稳定过表达及低表达Aurora-A肝癌亲本细胞系及肝癌放射抵抗细胞系，用NF-κB依赖性荧光素酶报告载体质粒转染，并测定荧光素酶活性。
3、Westernblot检测调控Aurora-A表达对NF-kB下游凋亡相关蛋白(Bcl-2，Mcl-1，PARP和caspase-3)表达的影响。
结果：
1、Westernblot检测显示，无论在细胞核内还是细胞质内，放射抵抗细胞株HepG2-R、SMMC-7721-R中的IκBα表达水平明显低于肝癌亲本细胞株HepG2、SMMC-7721(p＜0.01)。
2、Westernblot检测结果显示，放射抵抗细胞株HepG2-R、SMMC-7721-R中的p65蛋白表达水平明显高于肝癌亲本细胞株HepG2、SMMC-7721(p＜0.05，p＜0.01)。
3、荧光素酶活性实验显示，NF-κB在HepG2-R、SMMC-7721-R中的活性明显高于肝癌亲本细胞株HepG2、SMMC-7721(p＜0.01)。
4、Westernblot检测结果显示，IκBα在下调Aurora-A表达的放射抵抗HCC株HepG2-R/Lv-shAuro、和SMMC-7721-R/Lv-shAuro中的表达水平较对照组明显升高，而p65蛋白表达水平在下调Aurora-A表达的放射抵抗HCC株HepG2-R/Lv-shAuro、和SMMC-7721-R/Lv-shAuro中的表达水平较对照组明显降低；IκBα在过表达Aurora-A的亲本HCC株HepG2/Lv-Auro、和SMMC-7721/Lv-Auro中的表达水平较对照组明显降低，而p65蛋白表达水平在过表达Aurora-A表达的亲本HCC株HepG2/Lv-Auro、和SMMC-7721/Lv-Auro中的表达水平较对照组明显升高。
5、荧光素酶活性实验显示，NF-κB在下调Aurora-A表达的放射抵抗HCC细胞株HepG2-R/Lv-shAuro、SMMC-7721-R/Lv-shAuro中的活性明显低于肝癌亲本细胞株HepG2-R/Lv-shcontrol、SMMC-7721-R/Lv-shcontrol(p＜0.01)；NF-κB在过表达Aurora-A的亲本HCC细胞株HepG2/Lv-Auro、SMMC-7721/Lv-Auro中的活性明显高于对照组细胞株HepG2/Lv-control、SMMC-7721/Lv-control(p＜0.01)。
6、下调Aurora-A表达后，HepG2-R/Lv-shAuro、SMMC-7721-R/Lv-shAuro中的Bcl-2和Mcl-1蛋白表达水平较对照组明显下降，而PARP和caspase-3表达水平明显升高；Aurora-A过表达后，HepG2/Lv-Auro、SMMC-7721/Lv-Auro中的Bcl-2和Mcl-1表达水平较对照组明显升高，而PARP和caspase-3表达水平明显下降。
结论：
1、我们建立了放射抵抗HCC细胞系(HepG2-R和SMMC-7721-R)。
2、Aurora-A在放射抵抗HCC细胞中显著上调。
3、下调Aurora-A通过增强放射诱导的细胞凋亡显著增加放射抵抗HCC细胞的放射敏感性，而Aurora-A的过表达在其亲本HCC细胞中诱导相反的作用。4、Aurora-A通过抑制核IκBα蛋白的表达、促进P65蛋白表达，从而增强NF-κB活性，促进NF-κB途径下游效应分子的表达，包括上调凋亡抑制蛋白凋亡Bcl-2和Mcl-1的表达，下调凋亡促进蛋白PARP和caspase-3的表达，最终抑制凋亡，增强放射抵抗性，降低肝癌细胞放射敏感性。我们的研究结果首次证明Aurora-A对HCC的放射抵抗至关重要，并且靶向该分子将是HCC放射增敏的潜在策略。