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神经退行性疾病,如老年性痴呆(Alzheimer’s disease AD)、帕金森氏症(Parkinson’s disease PD)、萎缩性侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、和亨廷顿氏病(Huntington’s disease HD)等,临床表现为肢体运动和学习记忆等功能障碍,主要原因是神经元功能的缺失或死亡。目前没有理想的治疗手段,在我国AD和PD这两种疾病已经累及大约1000万人给个人家庭和社会带来沉重负担。研究表明,神经营养因子家族成员(neurotrophic factors, NTFs)等,显示了很好的中枢神经系统神经退行性疾病的治疗前景。脑源性神经营养因子(BDNF)是神经营养因子家族成员包括之一,与其特异性受体酪氨酸激酶家族成员trkB结合,激活下游的信号传导途径,而发挥神经营养生物活性。然而,血脑屏障(BBB)阻碍了大分子药物从血液中进入大脑发挥生理作用,人大脑血脑屏障(BBB)由血管内皮细胞紧密连接组成,BBB腔内面为血液,腔外面多为外膜细胞,星行细胞及少量的神经元。天然BDNF不能透过BBB进入大脑发挥神经营养活性。蛋白质转导结构域(protein transduction domain, PTD),如来源于人类Ⅰ型免疫缺陷病毒的转录激活蛋白(Trans-activator transcription, TAT)的PTD,是一类富含正电荷能够将与其物理或化学连接的化合物、蛋白质、或核酸类分子,带过细胞膜进入细胞浆,胞核内,甚至BBB,发挥各自的生物学功能的结构域。PTD/TAT介导的蛋白质可穿过由脑血管内皮细胞组成的BBB,使所携带蛋白进入大脑发挥生理作用,而使一些在正常情况下是不能通过BBB的蛋白进入脑组织。本实验中心前期通过基因工程的方法成功制备了编码成熟BDNF-TAT融合蛋白的基因,目的在于在世界上首先制备一种能通过BBB进入中枢神经系统,治疗神经退行性疾病的基因重组神经营养因子药物制剂。基于前期研究,本文采用重组质粒PET-30(a)-BDNF-TAT转化至大肠杆菌BL21(DE3)plysS中优化表达,经阳离子交换树脂优化纯化及精氨酸倍比稀释法复性BDNF-TAT融合蛋白,尾静脉给药KM种小鼠后研究其脑靶向性及其在脑组织中的分布,体外培养SD大鼠新生一周鼠背根神经节神经元检测BDNF-TAT融合蛋白的生物学活性,为进一步研究可透过血脑屏障药物BDNF-TAT融合蛋白治疗神经退行性疾病提供物质基础。目的1.研究重组质粒PET-30(a)-BDNF-TAT转化至大肠杆菌BL21(DE3)plysS后BDNF-TAT融合蛋白的表达,并优化BDNF-TAT融合蛋白在大肠杆菌中表达及纯化的条件；2.小鼠经尾静脉血管给予复性后BDNF-TAT融合蛋白,探讨其在小鼠脑组织中的脑靶向性及在小鼠脑组织中的分布；3.体外培养新生大鼠背根神经节神经元细胞,进一步研究复性后BDNF-TAT融合蛋白体外促进神经元存活生长的活性。方法1.根据前期课题组经基因工程办法制备的重组质粒PET-30(a)-BDNF-TAT及,本文将该重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)plysS,37℃, 1.0mM IPTG诱导4h后低温离心(4℃,5000 rpm)收集菌体,超声裂解,高速离心后收集各步骤样品,通过15%SDS-PAGE和Western Blot分析确定融合蛋白BDNF-TAT在大肠杆菌中的表达形式；分别选取25℃、30℃、33℃、37℃、40℃为不同的诱导温度,对诱导温度进行优化；分别选取0.1mM、0.5mM、1.0mM、1.5mM为IPTG诱导浓度,对IPTG诱导浓度经行优化；选取1、2、4、6、8为诱导时间,对诱导时间经行优化；收集各条件下大肠杆菌并经行15%SDS-PAGE和(?)WesternBlot分析确定BDNF-TAT融合蛋白在大肠杆菌中的最佳表达条件。2.重组质粒转化至大肠杆菌后,经25℃,0.5mM IPTG诱导4h后离心收集湿菌体,PBS重悬洗涤后用60%强度超声破碎仪裂解大肠杆菌,4℃、12000rpm低温高速高速离心去上清,沉淀用2M尿素和0.4%DOC洗涤并重复洗涤一次,低温高速离心去上清,包涵体沉淀用8M尿素4℃搅拌溶解14h,溶解后蛋白通过中高压层析系统泵入SP--Sepharose阳离子交换柱,选取pH7.0 NaCl浓度分别为0.1M和0.5M的洗脱液经行梯度洗脱优化不同离子强度对目的蛋白的洗脱能力；选取pH8.5,NaCl浓度为0.5M的洗脱液洗脱目的蛋白,对挂柱的目的蛋白经行分离纯化。洗脱后目的蛋白用0.4M精氨酸倍比稀释法除去目的蛋白中的尿素,同时复性融合蛋白BDNF-TAT。收集各步骤蛋白样品进行15%SDS-PAGE和Western Blot分析,确定最终过柱纯化优化方案。3.随机取9只KM种小鼠作为实验对象,分为给药组,阴性对照组和空白对照组,每组3只,将纯化复性后的BDNF-TAT融合蛋白溶解于适量生理盐水,给药组动物尾静脉注射4μg BDNF-TAT,而阴性对照组给予等体积生理盐水,空白对照组不给药。4h后断头取闹组织,全蛋白提取试剂盒提取脑组织中全蛋白,免疫印迹法(Western Blot)鉴定脑组织中所含BDNF-TAT,对所有组中目的蛋白以p-actin作为内参进行上样量标准化后,以BDNF-TAT与β-actin灰度值之比为脑组织中BDNF-TAT相对含量,应用单向方差分析方法,比较给药组,阴性对照组贺空白组之间BDNF-TAT的相对含量是否有统计学意义。4.随机取6只KM种小鼠作为实验对象,分为给药组和阴性对照组,每组3只,将纯化复性后的BDNF-TAT溶解于适量生理盐水,给药组动物尾静脉注射BDNF-TAT,而阴性对照组给予等体积生理盐水,4h后灌注4%多聚甲醛,断头取脑组织,小鼠脑组织4%多聚甲醛浸泡2h后浸入30%蔗糖溶液过夜,10μm厚度冰冻切片。切片用SABC免疫组织化学法鉴定BDNF-TAT在小鼠脑组织中的分布。5.摘取新生一周左右SD大鼠背根神经节,经胶原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶消化后用含10%FBS的DMEM培养基体外培养背根神经节神经元。将神经元细胞分为给药组,阳性对照组和空白对照组,给药组中DMEM培养基加入100ng/ml复性后融合蛋白BDNF-TAT,阳性对照组中DMEM培养基加入100ng/ml NGF,空白对照组中DMEM培养基不加入神经营养因子。培养基每2天换一次液,培养4天后用AChE神经元染色方法对神经元经行染色,观察神经元细胞生长情况。结果1.通过15%SDS-PAGE和Western Blot鉴定BDNF-TAT,大肠杆菌中表达BDNF-TAT融合蛋白在分子量约18kD处有表达,且在大肠杆菌裂解沉淀中目的蛋白较多,说明BDNF-TAT融合蛋白以包涵体沉淀形式存在；经不同温度,IPTG诱导浓度和诱导时间经行优化后,诱导温度在25℃,IPTG诱导浓度为0.5mmM诱导4h时BDNF-TAT融合蛋白在大肠杆菌中的表达量最高。2.经15%SDS-PAGE和Western Blot分析,包涵体蛋白经2M尿素和0.4%DOC洗涤后大部分杂蛋白被洗涤干净,且8M尿素将大部分包涵体蛋白溶解,溶解后蛋白经SP--Sepharose阳离子交换柱纯化后,大部分目的蛋白被pH8.5、NaCl浓度为0.5 M的洗脱液洗脱下来,0.4M精氨酸复性后蛋白纯度约为90%,每升菌能产出约4.8 mg目的蛋白。3. Western Blot鉴定脑组织中BDNF-TAT相对含量,对ECL发光显影胶片中给药组、阴性对照组和空白对照组中BDNF-TAT和β-actin的灰度扫描,以BDNF-TAT和p-actin的灰度比值作为各组中BDNF-TAT蛋白的相对表达量,结果以x±s表示,给药组中BDNF-TAT蛋白的相对表达量为1.897±0.286,阴性对照组中BDNF-TAT蛋白的相对表达量为0.615±0.234,空白对照组中BDNF-TAT蛋白的相对表达量为0.335±0.154。Levene检验方差齐性(P=0.447>0.05),方差齐。经单方向方差分析,各组间BDNF-TAT蛋白相对表达量有差异(F=39.019,P=0.000<0.05),差异有统计学意义。LSD法组间多重比较：给药组中BDNF-TAT相对表达量与阴性对照组中BDNF-TAT相对表达量相比(P=0.000<0.05),差异有统计学意义；给药组中BDNF-TAT相对表达量与空白对照组中BDNF-TAT相对表达量相比(P=0.000<0.05),差异有统计学意义；而阴性对照组中BDNF-TAT (?)目对表达量和空白对照组中BDNF-TAT相对表达量相比(P=0.188>0.05),差异没有统计学意义,说明BDNF-TAT通过外周给药能靶向至小鼠脑组织。4.SABC免疫组织化学法鉴定BDNF-TAT经尾静脉给药KM种小鼠后其在脑组织中的分布,给药组中融合蛋白BDNF-TAT阳性染色明显较强,而生理盐水组中阳性染色明显弱于给药组,其阳性染色主要分布于海马区CA1、CA3和DG区。AChE染色神经元后,空白对照组神经元细胞培养4天后胞体较小,细胞大部分死亡,突起较短。而给药组组和阳性对照组中神经元生长良好,突起较长,细胞数目明显较空白对照组多。每组孔中随机选取10个视野,经Image Pro Plus6.0软件测量细胞最长突起的长度,结果以x±s表示,结果给药组为143±13um,阳性对照组为154±13um,而空白对照组为64±15um, Levene检验方差齐性(F=0.039,P=0.961>0.05),方差齐。经单方向方差分析,各组间最长突起的长度有差异(F=126.523,P=0.000),差异有统计学意义。LSD法组间多重比较：给药组中最长突起长度与阳性性对照组中最长突起长度相比(P=0.087>0.05),差异没有统计学意义,而给药组中最长突起长度与空白对照组中最长突起长度相比(P=0.000<0.05),差异有统计学意义；阳性对照组中最长突起长度与空白对照组中最长突起长度相比(P=0.000<0.05),差异有统计学意义,说明BDNF-TAT在体外有能促进神经元突起生长。通过Image Pro Plus6.0软件测量神经元胞体总面积,结果给药组为2686±242um2,阳性对照组为2864±169um2,而空白对照组为397±97um2。Levene检验方差齐性(F=0.039,P=0.047<0.05),方差不齐。经Welch分析,各组间神经元胞体总面积有差异(F=997.983,P=0.000),差异有统计学意义。Dunnett T3法组间多重比较：给药组中神经元胞体总面积与阳性性对照组中神经元胞体总面积相比(P=0.199>0.05),差异没有统计学意义,而给药组中神经元胞体总面积与空白对照组中神经元胞体总面积相比(P=0.000<0.05),差异有统计学意义；阳性对照组中神经元胞体总面积与空白对照组中神经元胞体总面积相比(P=0.000<0.05),差异有统计学意义,证明BDNF-TAT在体外有保护神经元生长和存活的生物学活性。结论1. BDNF-TAT融合蛋白能通过重组质粒PET-30(a)-BDNF-TAT转化至大肠杆菌BL21(DE3)plysS中以包涵体形式表达,分子量约为18kD左右。2.包涵体蛋白经表达纯化优化并复性后,得到高纯度活性BDNF-TAT融合蛋白,每升菌产出目的蛋白约4.8mmg,纯度约为90%。3.尾静脉注射复性后融合蛋白BDNF-TAT经Western Blot分析后,给药组小鼠脑组织中BDNF-TAT的相对含量较阴性对照组和空白对照组明显高(P>0.05),且阴性对照组与空白对照组中BDNF-TAT的相对含量无差异(P<0.05),证明复性后融合蛋白BDNF-TAT能通过外周尾静脉给药靶向至小鼠脑组织中。4.SABC免疫组织化学法证明BDNF-TAT融合蛋白经外周尾静脉给药小鼠后,脑组织中BDNF-TAT主要分布在海马区CA1、CA3和DG区。5.体外培养背根神经节神经元细胞表明,BDNF-TAT融合蛋白能促进神经元的生长存活。