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缺血性脑卒中(Ishemic Stroke)是位列于心血管疾病、癌症之后,导致中老年人死亡的主要脑血管意外类疾病。缺血性脑卒中的特点是其高死亡率和高致残率,约有1／3的患者在发病后死亡,而幸存者由于偏瘫、失语、痴呆等后遗症丧失工作甚至生活自理能力；严重危害人们的健康,并为家庭和社会带来沉重的负担。目前用于缺血性脑卒中一线临床治疗的药物多集中于溶栓抗凝类药物,而神经保护剂所占比重较小。本研究拟以缺血性脑卒中病理过程中神经元离子稳态失衡为切入点,围绕钾通道的过度开放及细胞内钾的丢失,探讨慢性失活型延迟整流钾通道Kv2.1在由氧糖剥夺模型所介导的细胞损伤中发挥的作用；已知药物多奈派齐(donepezil)具有钾通道阻断的特性,研究其能否独立于胆碱能系统之外,仅通过对电压依赖性钾通道的调节即可发挥抗脑缺血细胞损伤保护作用；围绕钠钙交换体(NCX)功能,筛选NCX调节剂类化合物,探讨NCX激动剂在缺血性脑卒中发挥的神经元保护作用。为脑缺血及再灌注所造成神经元损伤的治疗、以及抗脑缺血神经保护剂类药物的研发提供线索和理论依据。本论文的主要研究内容如下：第一部分：延迟整流钾通道Kv2.1在氧糖剥夺介导细胞损伤中的作用1.延迟整流钾通道阻断剂对脑缺血的保护作用在脑缺血病理过程中,由于能量供给障碍引发的离子稳态平衡失调是造成神经元损伤的始动因素之一。目前的研究结果表明,钾离子的过度外流和细胞内钾的大量丢失是造成脑缺血细胞损伤和凋亡的主要机制，抑制钾通道的过度开放则可能发挥对脑缺血细胞损伤的保护作用。本课题组的前期研究结果表明：大鼠制备脑缺血模型后,脑缺血半影区域延迟整流钾通道Kv2.1的mRNA表达水平显著升高。所以本研究先应用延迟整流钾通道阻断剂四乙铵(TEA)验证了阻断延迟整流钾通道在脑缺血中的神经元保护作用,实验结果显示：大脑中动脉阻塞模型大鼠侧脑室注射TEA(5ug·kg-1)可以显著降低实验动物的脑梗死体积。2.野生型HEK293细胞转染Kv2.1钾通道后对氧糖剥夺损伤敏感性增强Kv2.1钾通道在中枢神经系统广泛表达,并且研究表明Kv2.1电流是神经元外向延迟整流钾电流的主要成分；为了研究Kv2.1钾通道在由脑缺血所造成细胞损伤中的作用同时排除神经元上其他类型离子通道的影响,本研究应用高表达Kv2.1钾通道亚型的转基因细胞—Kv2.1／HEK293细胞。在钾通道电流无明显衰减的前提下,应用全细胞膜片钳技术观察和记录野生型HEK293细胞和转染Kv2.1钾通道的HEK293细胞外向钾通道电流差别。实验结果显示：同野生型HEK293细胞相比,Kv2.1／HEK293细胞的外向电流密度增高超过10倍；并通过电生理学实验验证其属于延迟整流钾电流成分。应用氧糖剥夺模型模拟脑缺血病理过程中的缺血缺氧状态,MTT实验显示：同野生型HEK293细胞相比,氧糖剥夺使转染Kv2.1钾通道的HEK293细胞存活率显著降低。由Hoechst33342标记的细胞凋亡实验显示：氧糖剥夺使转染Kv2.1钾通道的HEK293细胞凋亡率比其载体细胞显著升高。以上结果说明Kv2.1钾通道同氧糖剥夺引起的细胞损伤密切相关。3.氧糖剥夺对转染Kv2.1钾通道的HEK293细胞电生理学性质的影响Kv2.1钾离子通道属于氧敏感型钾通道,文献报道在缺氧条件下,Kv2.1钾通道会受到轻微抑制。本研究发现Kv2.1／HEK293细胞氧糖剥夺处理后,Kv2.1电流降低为有氧状态的约82%,同文献报道结果基本一致；同时本研究观察到氧糖剥夺对Kv2.1钾通道的激活和失活无显著影响。但在应用膜片钳全细胞电流钳制观察细胞膜电位的实验中发现：氧糖剥夺可以使Kv2.1／HEK293细胞膜电位向去极化方向移动并维持在+2mV左右。由于Kv2.1通道特点是该电流激活的电压和时间依赖性,基本上无自主灭活,除非细胞的复极化；所以由氧糖剥夺引起的细胞膜持续去极化状态可以激活Kv2.1通道,使其持续开放并介导钾离子的过度外流,从而引起继发的细胞损伤。4.钾离子浓度对提取线粒体膜电位的影响线粒体膜电位的稳定不但是线粒体能量代谢正常进行的前提,也是减缓线粒体通透转运孔开放,避免凋亡通路激活的重要因素。以线粒体对于荧光染料Rhodamin123的摄取速率和摄取量表示线粒体膜电位的高低,观察细胞内液中钾离子浓度同线粒体膜电位间的关系。结果显示：提取线粒体的膜电位随着孵化液中钾离子浓度的降低(用氯化铯或氯化胆碱代替细胞内液中的钾)而降低。提示线粒体膜电位同细胞内钾离子浓度密切相关,抑制钾离子的过度外流有助于稳定线粒体膜电位,减少线粒体凋亡因子的释放。5.Kv2.1钾通道对氧糖剥夺损伤介导的线粒体凋亡因子释放的影响氧糖剥夺损伤可以引起线粒体呼吸和能量代谢障碍,同时造成线粒体膜电位降低,最终导致线粒体通透转运孔(MPTP)开放,膜通透性增加,凋亡相关蛋白释放,进而引发凋亡级联反应。本研究应用Westen blot方法观察了氧糖剥夺对Kv2.1／HEK293线粒体细胞凋亡因子Cyto-C和AIF释放的影响,实验结果显示：同野生型HEK293细胞相比,氧糖剥夺6小时使转染Kv2.1钾通道的HEK293细胞胞浆中的Cyto-C和AIF水平显著升高；提示Kv2.1钾通道同氧糖剥夺损伤介导的线粒体凋亡因子释放密切相关。第二部分：Donepezil对氧糖剥夺介导Kv2.1／HEK293细胞损伤的保护作用1. Donepezil对Kv2.1钾通道的阻断作用在Kv2.1钾通道电流无明显衰减的前提下,应用全细胞膜片钳技术观察和记录第二代胆碱酯酶抑制剂donepezil对转染Kv2.1钾通道HEK293细胞Kv2.1电流的抑制作用。实验结果显示：donepezil可以呈剂量依赖性的抑制Kv2.1钾电流；对其量效曲线进行分析得到donepezil抑制Kv2.1钾通道的IC50值为7.59μM；donepezil浓度为30μM时对Kv2.1钾通道的抑制接近最大值,当去极化到+60mV时30μMdonepezil可以将Kv2.1电流抑制到对照组的49.93±6.59%。同时,选择经典延迟整流钾通道阻断剂TEA作为阳性对照药物,30μM donepezil和10mM TEA对Kv2.1钾电流的抑制程度接近。2. Donepezil对氧糖剥夺Kv2.1／HEK293细胞电生理性质的影响氧糖剥夺可以使转染Kv2.1钾通道HEK293细胞的Kv2.1电流有所降低,donepezil则可以使氧糖剥夺处理的Kv2.1／HEK293细胞Kv2.1电流进一步降低,并且这种抑制程度要远远高于氧糖剥夺对Kv2.1电流的抑制。Donepezil对氧糖剥夺Kv2.1／HEK293细胞Kv2.1钾通道稳态激活曲线无显著影响,但Donepezil可以使氧糖剥夺Kv2.1／HEK293细胞Kv2.1钾通道失活曲线向超极化方向移动8.73mV；提示donepezil对氧糖剥夺Kv2.1钾通道的抑制作用可能同加速通道的失活密切相关。Kv2.1／HEK293细胞膜电位在-30mV左右,氧糖剥夺处理后细胞膜电位去极化至2.23±2.06mV,氧糖剥夺和30μM donepezil或10mM TEA共同作用后细胞膜电位仍然向去极化方向移动到-5.36±1.37mV和-3.08±1.55mV；提示donepezil和TEA可以起到稳定氧糖剥夺Kv2.1／HEK293细胞膜电位的作用,进而降低钾通道的开放频率以减少由细胞膜去极化造成的钾离子外流。但在0mV左右的膜电位下,Kv2.1还是可以被激活开放,所以本研究进一步观察了细胞膜电位是0mV时donepezil对氧糖剥夺Kv2.1／HEK293细胞钾电流的影响。实验结果显示：氧糖剥夺处理后,Kv2.1／HEK293细胞膜电位0mV时的电流密度为89.90±8.26 pA／pF；30μMdonepezil和10mM TEA分别可以使氧糖剥夺Kv2.1／HEK293细胞0mV时的电流密度降低到27.11±5.22 pA／pF和38.71±5.53pA／pF；提示在由氧糖剥夺引起细胞去极化到0mV左右时donepezil可以通过对Kv2.1钾电流的显著抑制作用避免细胞内钾的过度丢失,从而发挥保护作用。3. Donepezil对氧糖剥夺介导Kv2.1／HEK293细胞损伤的保护作用应用MTT法观察donepezil对氧糖剥夺Kv2.1／HEK293细胞存活率的影响,结果表明：同有氧对照组相比,氧糖剥夺损伤模型组的细胞生存率显著降低至33.26±1.09%; donepezil可以剂量依赖性的提高氧糖剥夺损伤Kv2.1／HEK293细胞存活率,30μM donepezi和10mM TEA分别可以使细胞存活率升高至47.29±2.59%和44.03±1.95%。细胞凋亡实验发现：同野生型HEK293细胞相比,氧糖剥夺24小时使Kv2.1／HEK293细胞的凋亡率显著升高至52.82±2.01%;30μM donepezil可以使细胞凋亡率显著降低至23.70±1.75%；10mM TEA可以使细胞凋亡率显著降低至26.35±2.11%。提示在氧糖剥夺介导的Kv2.1／HEK293细胞凋亡中,donepezil通过阻断Kv2.1钾通道可以发挥对抗细胞凋亡作用。4. Donepezil对氧糖剥夺损伤Kv2.1／HEK293细胞线粒体凋亡因子释放的抑制作用氧糖剥夺损伤可以使Kv2.1／HEK293细胞胞浆细胞色素C和凋亡诱导因子水平升高,并且在氧糖剥夺6小时后同野生型HEK293细胞相比有显著性差异,实验结果显示：同氧糖剥夺6小时损伤模型相比,30μM donepezil和10mM TEA可以显著降低氧糖剥夺Kv2.1／HEK293细胞胞浆细胞色素C水平；同时30μM donepezil还可以使Kv2.1／HEK293细胞胞浆凋亡诱导因子水平显著降低,而TEA对Kv2.1／HEK293细胞胞浆凋亡诱导因子水平影响不明显。以上结果提示,donepezil可以通过阻断Kv2.1钾离子通道,进而降低由氧糖剥夺介导钾离子大量外流所引起的胞浆细胞色素C和凋亡诱导因子水平的升高,发挥抗凋亡作用。5. Donepezil对氢糖剥夺损伤Kv2.1／HEK293细胞PKC-delta水平的影响PKC-delta属于蛋白激酶C家族成员。研究表明PKC-delta参与细胞凋亡的发生,细胞内PKC-delta水平同脑缺血损伤造成的神经元凋亡相关。PKC-delta被活化后才可以诱导细胞凋亡,目前报道有三种方式可以使PKC-delta活化,分别是PKC-delta的膜转位、酪氨酸磷酸化和溶蛋白性裂解；PKC-delta激活的结果是使细胞内完整形式的PKC-delta蛋白水平降低,其激活产物参与其他信号通路的调节。本研究发现,在氧糖剥夺6小时后,Kv2.1／HEK293细胞胞浆内完整形式的PKC-delta水平显著降低,提示PKC-delta的激活；但在给予donepezil和TEA后对胞浆内已经降低PKC-delta水平无明显影响。提示donepezil阻断钾通道并不通过对胞浆内PKC-delta水平的调节发挥其抗凋亡细胞保护作用。第三部分：基于NCX功能的抗脑缺血药物筛选钠钙交换体(Na+/Ca2+exchanger, NCX)是一种双向转运蛋白,以3 Na+：1Ca2+的方式转运细胞膜两侧的钠离子和钙离子。在脑缺血的病理过程中,神经元的钠钙稳态失衡是造成细胞损伤的重要因素之一,近期研究表明NCX在脑缺血的病理过程中发挥着神经元保护作用,是一个潜在的脑缺血治疗药物作用靶点。本实验中采用Port-a-patch全细胞膜片钳技术,观察了高通量筛选出的可能影响NCX功能的化合物对转基因细胞上NCX1、NCX2和NCX3三种亚型的作用。结果表明,有4个化合物对NCX呈抑制作用；有9个化合物对NCX的激动作用较明显；对其进一步研究期望可以开发成为具有脑缺血治疗前景的药物。