【摘 要】
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糖尿病患者的创面难愈合是一个备受临床和社会关注的公共健康问题。糖尿病足创面难愈合受多种因素影响,包括创面肉芽组织形成障碍、供血不足、生长因子表达异常等。创面愈合延迟与受损,可导致截肢甚至死亡,所以早期治疗对防止糖尿病足的发展至关重要。目前糖尿病足慢性创面治疗主要是单分子单靶点干预,其治疗效果有限。因此,开发一种复合功能敷料有望能以多靶点的方式对糖尿病足溃疡的早期阶段进行有效干预和促进慢性难愈合创面
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糖尿病患者的创面难愈合是一个备受临床和社会关注的公共健康问题。糖尿病足创面难愈合受多种因素影响,包括创面肉芽组织形成障碍、供血不足、生长因子表达异常等。创面愈合延迟与受损,可导致截肢甚至死亡,所以早期治疗对防止糖尿病足的发展至关重要。目前糖尿病足慢性创面治疗主要是单分子单靶点干预,其治疗效果有限。因此,开发一种复合功能敷料有望能以多靶点的方式对糖尿病足溃疡的早期阶段进行有效干预和促进慢性难愈合创面修复,对于临床预防和控制糖尿病足溃疡恶化和改善预后具有重要意义。角蛋白作为一种天然的生物材料,因具有良好的生物活性和生物相容性已广泛应用于止血、创伤修复等生物医学工程领域。本论文基于重组角蛋白纯度高、成分单一、质量可控的优点,联合重组碱性成纤维细胞生长因子（b FGF）促血管新生的作用,设计并制备K31/b FGF复合凝胶敷料达到促创面再上皮化和血管再生的治疗效果,以解决糖尿病足溃疡创面难愈合这一难题。本论文通过重组表达等技术获得重组蛋白K31,并制备了K31/b FGF复合凝胶敷料,考察了复合凝胶敷料的生物安全性和稳定性并对其制定了质量标准;通过细胞实验和建立II型糖尿病鼠的全层皮肤缺损模型评价K31/b FGF复合凝胶敷料的体内外创面愈合效果。本论文主要研究内容和结论如下:（1）采用基因重组技术构建K31重组表达载体并进行表达和纯化,对获得的重组角蛋白K31进行理化性质表征。SDS-PAGE结果显示其分子量为47 k Da左右,条带单一,表明纯化效果好;CD分析表明K31的二级结构主要由α-螺旋构成;FT-IR显示K31中具有蛋白质肽键的特征吸收峰;UV-Vis结果显示在270 nm有最大吸收值,与文献报道中人发提取角蛋白以及重组角蛋白的结果相似。表明本实验获得的K31与提取角蛋白的性质相似且纯度高。（2）对K31/b FGF复合凝胶敷料的制备工艺优化和修复效果进行评价。通过细胞增殖和迁移实验确定重组角蛋白K31的最适工作浓度为0.2 mg/m L;采用单因素和正交试验方法进行处方优化,最终确定配方为2%羟乙基纤维素（HEC）、0.5%羧甲基纤维素钠（CMC-Na）、10%甘油、10%山梨醇、0.7%苯氧乙醇,0.2 mg/m L重组角蛋白K31、0.5μg/m L b FGF。根据最终处方制备K31/b FGF复合凝胶敷料,SEM分析其为多孔网络结构,并且具有缓慢释放b FGF生长因子的效果。体外细胞实验发现,48 h时凝胶敷料组的细胞相对增殖率达240%,细胞划痕中细胞迁移速率达95.5%,明显优于对照组。通过高糖高脂饲料喂养和链脲佐菌素（STZ）联合诱导构建II型糖尿病SD大鼠,采用全层皮肤缺损模型进行功效性评价。K31/b FGF复合凝胶敷料组第14天时,创面愈合率达86.1%,显著高于对照组（56.1%）和贝复新阳性药物组（64.6%）;组织病理学H＆E染色结果显示K31/b FGF复合凝胶敷料组中新生血管和成纤维细胞的数量多于对照组和贝复新阳性药物组,表明K31/b FGF复合凝胶敷料具有更好的促进糖尿病慢性创面愈合的效果。此外,q RT-PCR实验结果发现,K31/b FGF复合凝胶敷料中上皮细胞标志物E-Cadherin表达下调,而间质细胞标志物Vimentin、Snail、Fibronectin、α-SMA的m RNA表达水平上调,推测K31/b FGF复合凝胶敷料可能通过参与调控角质形成细胞发生EMT促进其迁移,加速创面处再上皮化,从而促进创面愈合。（3）参考《中国药典》、ISO-10993和GB/T-16886等一系列标准和行业标准对K31/b FGF复合凝胶敷料进行生物安全性评价以及质量指标的测定。实验表明凝胶敷料有良好的细胞相容性和血液相容性。在动物体内对皮肤刺激、全身急性毒性、免疫毒性及生物降解性进行评价,结果表明K31/b FGF复合凝胶敷料不具有刺激反应、无急性毒性反应、可生物降解、无免疫毒性。产品的稳定性符合标准,并初步制定了K31/b FGF复合凝胶敷料的质量标准,为后续产品的开发与临床应用奠定基础。综上所述,K31/b FGF复合凝胶敷料的质量稳定、生物安全性好,在糖尿病鼠创面修复方面有良好的功效。本论文的完成可为K31/b FGF复合凝胶敷料医疗器械证的申请奠定基础,有望为糖尿病足溃疡的临床治疗提供新途径。
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