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血管性痴呆(vascular dementia,VD)是由于各种脑血管病引起的获得性认知功能障碍,以学习、记忆功能缺损为主要症状,可伴有语言、运动、视空间及人格障碍等。学习和记忆是大脑的高级功能之一。目前认为,海马与学习、记忆等高级认知功能密切相关,其神经元形态和功能的正常与否对学习、记忆的形成和维持具有重要意义。长期记忆形成需要环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)-蛋白激酶A((Protein kinaseA,PKA)-cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element bindingProtein,CREB)通路的活动。补阳还五汤由黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、桃仁、红花组成,具有补气、活血、通络的功能,目前在临床上主要治疗气虚血疲所致的中风。实验研究发现补阳还五汤及其有效部位组方具有对抗脑缺血及缺血再灌注损伤,降低血液粘滞度,对抗血小板聚集,促进神经元损伤恢复、抑制脑细胞凋亡、调节脑组织能量代谢和一氧化氮的生成等作用。本文通过探讨cAMP-PKA-CREB信号通路在VD中的变化,观察补阳还五汤治疗VD的效果并探讨其作用机制。
第一部分补阳还五汤对血管性痴呆大鼠行为学和海马CA1区神经元形态学的影响
目的:观察补阳还五汤对血管性痴呆大鼠模型行为学和海马组织学的影响。
方法:健康成年SD雄性大鼠96只,分为假手术组、VD模型组、补阳还五汤组、尼莫地平组。采用改良的Pulsinelli’s四血管阻断(four-vesselocclusion,4VO)方法制备VD大鼠模型,分别给予补阳还五汤(灌胃给药50g/kg/d))、尼莫地平(灌胃给药20mg/kg/d)干预治疗。术后28d,采用水迷宫试验进行学习和记忆成绩测试,观察行为学改变；用HE染色观察海马CA1区病理学特征变化。
结果:1.补阳还五汤对VD大鼠水迷宫逃避潜伏期的影响:与假手术组比较,模型组逃避潜伏期明显延长(P<0.05)；与模型组相比,补阳还五汤组和尼莫地平组在逃避潜伏期均显著缩短(P<0.05)；补阳还五汤组和尼莫地平组相比逃避潜伏期无明显区别(P>0.05)。2.补阳还五汤对VD大鼠水迷宫跨越平台次数的影响:与假手术组相比,模型组大鼠跨越平台次数均明显减少(P<0.05)；与模型组相比,补阳还五汤组和尼莫地平组跨越平台次数均显著增多(P<0.05)；补阳还五汤组和尼莫地平组相比大鼠跨越平台次数无明显区别(P>0.05)。3.补阳还五汤对VD大鼠海马CA1区神经元形态的影响:假手术组表现为正常组织形态,海马CA1区神经细胞排列整齐,均匀,细胞结构完整；模型组CA1区海马神经细胞排列散乱,界限不清楚,部分神经元正常细胞结构消失；补阳还五汤组及尼莫地平组病理改变明显减轻。4.补阳还五汤对大鼠海马CA1区正常神经细胞数目的影响:与假手术组比较,模型组海马神经元数目明显减少(P<0.05)；补阳还五汤组和尼莫地平组海马神经元数目明显多于模型组(P<0.05)；且补阳还五汤组与尼莫地平组比较无明显差别(P>0.05)。
小结:1.4VO法可较好模拟血管性痴呆的慢性持续性缺血再灌注损伤,导致大鼠学习记忆能力下降和海马CA1区神经元的损伤。2.补阳还五汤对VD大鼠的海马神经元形态学损伤具有一定的改善作用,能提高痴呆模型大鼠的学习和记忆能力。
第二部分补阳还五汤对血管性痴呆大鼠海马cAMP-PKA-CREB信号通路的影响
目的:观察补阳还五汤对VD大鼠海马cAMP-PKA-CREB信号通路的影响。
方法:实验分组和VD大鼠模型制备方法同第一部分,采用放射免疫分析法检测海马cAMP含量、免疫印迹法检测海马PKAc蛋白表达、电泳迁移率改变分析法观察大鼠CREB和C/EBP的DNA结合活性的变化。
结果:1.补阳还五汤对VD大鼠海马组织cAMP含量的影响:与假手术组比较,VD模型组大鼠海马组织cAMP含量显著降低(P<0.01)；与VD模型组比较,尼莫地平组与补阳还五汤组大鼠海马组织cAMP含量显著升高(P<0.01)；尼莫地平组、补阳还五汤组大鼠海马组织cAMP含量无明显差异(P>0.05)。2.补阳还五汤对VD大鼠海马组织PKAc蛋白表达的影响:与假手术组比较,模型组大鼠海马组织PKAc蛋白表达水平显著降低(P<0.01)；与模型组比较,尼莫地平组与补阳还五汤组海马组织PKAc蛋白表达水平显著升高(P<0.01)；尼莫地平组、补阳还五汤组大鼠海马组织PKAc蛋白表达水平之间无明显差异(P>0.05)。3.补阳还五汤对VD大鼠海马组织CREB的DNA结合活性的影响:与假手术组比较,VD模型组大鼠海马组织CREB的结合活性显著降低(P<0.01)；与模型组比较,尼莫地平组与补阳还五汤组海马组织CREB的结合活性显著升高(P<0.01)；尼莫地平组、补阳还五汤组大鼠海马组织CREB的结合活性之间无明显差异(P>0.05)。4.补阳还五汤对VD大鼠海马组织C/EBP的DNA结合活性的影响:与假手术组比较,模型组大鼠海马组织C/EBP结合活性显著降低(P<0.01)；与模型组比较,尼莫地平组与补阳还五汤组海马组织C/EBP结合活性显著升高(P<0.01)。
小结:1.海马cAMP-PKA-CREB信号通路的损伤参与了VD的发病机制。2.补阳还五汤通过增加VD海马cAMP含量、PKAc蛋白表达、CREB和C/EBP的DNA结合活性,增强cAMP-PKA-CREB信号通路的作用。
结论:补阳还五汤可上调VD大鼠海马cAMP-PKA-CREB信号通路,从而改善VD大鼠海马神经元损伤和行为学障碍。