葡萄金黄化植原体基因芯片检测技术及RFLP分析的研究

• 作 者: 乾义柯
• 机 构: 新疆农业大学
• 出 处: 新疆农业大学
• 发表日期: 2010年期
• 关键词: 葡萄金黄化植原体 基因芯片 PCR 限制性片段长度多态性

本研究通过对植原体15个组主要代表种的16SrDNA序列比对分析,设计植原体基因芯片引物及探针,以期为葡萄金黄化植原体(Flavescence dorée,FD)的检测及植原体各亚型的鉴定提供一种快速、灵敏、高通量的检测途径。研究所设计的芯片引物扩增植原体得到的片段大小(约290bp)均与预期结果一致,说明所建立的荧光标记PCR反应体系正常;探针特异性检测试验表明:植原体属探针(Phy探针)只有在检测植原体时才出现阳性信号,FD探针只有在检测16SrV植原体时才出现阳性信号,PaWB探针只有在检测泡桐丛枝病(PaWB)植原体时才出现阳性信号,说明所设计的探针特异性强;灵敏度检测试验表明:利用FD基因扩增产物构建质粒检测基因芯片的检测灵敏度达模板量103拷贝/μL,灵敏度要高于普通PCR,且通过检测结果可直接对不同植原体种做出准确鉴定,还具有可同时检测多种样品中不同病原的特点;芯片稳定性验证结果表明:本研究所设计的芯片重复性好、稳定性强,相同杂交条件下,批次内和批次间的基因芯片都可检测到明显的杂交信号,但不同批次及批次间的芯片检测信号存在一定差异,只可做定性判定;对芯片的最佳杂交时间、杂交温度、杂交液成分设不同梯度进行优化,确定杂交温度45℃,杂交时间1h,杂交液2.5%甲酰胺,0.2%SDS,6×SSC为最佳杂交体系。最终成功构建了FD基因芯片检测体系。采用植原体通用引物R16mF2/R16mR1对16SrV植原体进行扩增,成功构建重组质粒,并序列测定,测定结果与GenBank公布序列一致。用Xmn I、Xsp I、Taq I和Rsa I 4种限制性内切酶对所扩增的16SrV植原体16SrDNA进行酶切,琼脂糖凝胶电泳,结果表明:除葡萄金黄化C型(FD-C)和悬钩子矮化(RUS)植原体之间没有出现可相互区分的特异性条带外,其它各植原体之间都可以通过特异性条带的比较进行区分;Taq I和Rsa I两种限制性内切酶分别对16SrV-D和16SrV-B亚组的植原体特异。对新疆主要葡萄种植区进行葡萄黄化类植原体病害调查,将疑似症状的植株进行PCR检测和芯片检测,检测结果表明:新疆地区尚未发现葡萄黄化植原体病害;新疆阿克苏地区枣园中发现枣疯病(JWB)植原体,该植原体与FD属于同一组(16SrV)。目前新疆还没有此类病害的发生,但属于该病发生的适生区,因此有必要加强对本地区葡萄黄化类植原体病的检测和预防工作。