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一、研究目的和意义恶性肿瘤是人类死亡的主要原因之一。肿瘤的早期诊断和治疗是肿瘤患者获得长期生存的主要途径。目前对实体瘤的诊断临床上主要是依靠影像学的方法，但传统的CT、MRI和X线成像均是建立在疾病解剖结构异常的基础之上，往往是在疾病的终未阶段。由于存在“同病异影，异病同影”，导致一些非典型(如肺部孤立结节)或少见、早期实体瘤的定性诊断困难；PET/CT被认为是目前对实体瘤进行早期定性定位诊断最佳的检查方法，但临床常用的PET检查示踪剂18F-FDG是针对病变对葡萄糖摄取率的高低来间接判断其良恶性，而并非肿瘤特异性示踪剂，存在假阳性和假阴性；活检是肿瘤定性诊断的金标准，但某些特殊部位的病变(如心脏、大血管周围)，活检取材风险较大，且能够活检的肿瘤通常已是中晚期，患者往往已丧失最佳的治疗时间。因此，急需探索一种无创、有效的在疾病的分子水平进行早期定性诊断的新方法。随着分子生物学的发展以及分子探针在影像学中的不断应用，影像医学已从对传统的解剖和生理功能的研究深入到分子水平成像，尤其是近年快速发展的MR分子成像技术为肿瘤的早期定性诊断提供了新思路。以MR报告基因表达成像为显像模式的MR分子影像学是目前的研究热点。所谓MR报告基因，即基因所表达的产物或其与携带影像标记物的分子探针特异性结合，从而引起影像信号改变的基因。酪氨酸酶基因(tyrosinase,Tyr)作为MR报告基因已引起众多学者的关注，成为目前的研究热点。酪氨酸酶基因表达生成酪氨酸酶，酪氨酸酶是黑色素细胞生成的限速酶，它通过催化多种反应可在各类非黑色素细胞中生成黑色素。而黑色素的一个显著特点是带有大量阴离子，对各种金属阳离子具有高亲和力(可达自身重量的35%)，可吸附细胞外液和细胞内的金属离子，尤其是Fe3+。据测算平均每克黑色素就有多达1020个Fe3+吸附位点。Fe3+是一种顺磁性物质(类似于Gd3+对比剂)，MR信号的变化与Fe3+的浓度密切相关。在一定的浓度范围内，以显著缩短周围组织氢质子的纵向驰豫时间(T1)为主，靶组织表现为MR T1特征性高信号，且信号增高与Fe3+聚集的量成线性相关。Fe3+是人体生命活动所必须的金属元素，人体就是一个巨大的铁库。酪氨酸酶基因作为MR分子成像的报告基因，是以内源性Fe3+为成像的基础，成像过程中避免了外源性示踪剂(如SPIO)会随着细胞的分裂分化信号逐渐丢失的缺点，也不需要分子探针作用于底物，因此是一种较为理想的MR成像基因。由于MR T1WI信号主要是由黑色素形成的量决定的，平均信号强度与酪氨酸活性和黑色素之间存在极显著的相关性，因此可通过测量MR T1WI的信号强度来反应酪氨酸酶基因在转染细胞内的表达水平，同时可间接反映标记基因的活性，两者之间存在明显的线性关系。因而黑色素可成为MR的分子探针。如何使酪氨酸酶基因仅在肿瘤细胞中表达而不在其他正常组织或细胞中表达，是实现肿瘤特异性诊断的关键。目前已知的肿瘤特异性抗原启动子特异性太强，如AFP启动子只在肝癌细胞中表达、CEA启动子只在部分消化道肿瘤或肺癌中表达、PSA启动子只在前列腺癌中表达，如果用这些启动子来启动下游酪氨酸酶基因表达，只适用于具有该抗原的恶性肿瘤，诊断窗口较窄。因此需要寻找一种广谱的肿瘤特异性抗原启动子，在该启动子的作用下，其下游的报告基因只在肿瘤细胞中表达，而在正常细胞中不表达。端粒酶作为肿瘤无限增殖的必要条件，在绝大部分恶性肿瘤中表达，而在正常体细胞中，除少数增生旺盛的细胞及干细胞有少量表达外，其余均为阴性。人端粒酶逆转录酶(hTERT)作为端粒酶的限速酶，在端粒酶的活性调控中具有重要作用。我们过去的研究表明hTERT只在恶性肿瘤及部分癌前组织中表达，而正常组织细胞中不表达，针对hTERT的肿瘤免疫基因治疗只杀伤hTERT阳性的肿瘤细胞，而对正常体细胞、尤其是低表达hTERT的淋巴细胞不具有杀伤活性。由此可见，端粒酶的活性是通过hTERT基因的转录机制而严格调控的，而hTERT基因的转录又受hTERT启动子的调控。由于端粒酶在85%以上的恶性肿瘤细胞或组织中表达，因此，hTERT启动子具有良好的肿瘤靶向性，可以作为一种肿瘤特异性启动子用于肿瘤的靶向性诊断及治疗。基于以上分析，本课题拟以hTERT启动子作为肿瘤靶向性启动子，驱动MR报告基因----酪氨酸酶基因的表达，研究基于hTERT启动子驱动酪氨酸酶报告基因的表达在MR诊断恶性肿瘤中的价值，为MR在占位性病变定性诊断中的应用提供理论依据。本课题组在上一个国家自然科学基金项目(No:30871150)的资助下，已经设计并成功构建了hTERT优化型启动子的治疗性慢病毒载体pLenti-hTERTp/CD-IRES2-EGFP和pLenti-CMVp/CD-IRES2-EGFP。体内外研究表明，该优化型hTERT启动子驱动的自杀基因CD只杀伤端粒酶阳性的肿瘤细胞，而对端粒酶阴性的肿瘤细胞不起作用，说明我们设计并构建的hTERT启动子具有明显的端粒酶靶向性。综上所述，本项目拟在前期相关研究的基础上，以hTERT作为酪氨酸酶基因的启动子，利用hTERT启动子的端粒酶特异性，使酪氨酸酶基因只在端粒酶阳性的恶性肿瘤细胞中表达生成黑色素，吸附细胞外液和细胞内的Fe3+，然后借助高分辨率的MRI检测技术实现肿瘤的早期诊断。期望通过上述研究，为基于hTERT启动子的酪氨酸酶报告基因的表达在MR占位性病变中的定性诊断提供理论依据。二、研究方法1.分别构建基于端粒酶特异性hTERT启动子和非特异性CMV启动子的含有MR报告基因(Tyr基因)和EGFP绿色荧光蛋白的双报告基因系统的慢病毒表达载体(pLenti-hTERT/Tyr-IRES2-EGFP与pLenti-CMV/Tyr-IRES2-EGFP)首先从公司购买含有MR报告基因酪氨酸酶基因(Tyrosinase)全长编码基因的Hum-ORF-M13，转化感受态DH5-ɑ细菌及扩增抽提，采用PCR扩增Tyrosinase基因全长cDNA，与T载体连接后获得pMD19-Tyr质粒，酶切该质粒即可得到Tyr片段；用EcoR Ⅰ和Sal I双酶切我们将前期已经成功构建的hTERT/CD-IRES2-EGFP和CMV/CD-IRES2-EGFP质粒，得到线性hTERTp-EGFP片段和线性CMVp-EGFP片段；用T4DNA连接酶将Tyr片段分别与线性hTERTp-EGFP片段和线性CMVp-EGFP片段连接，即可得到本实验所需要的hTERT/Tyr-IRES2-EGFP和CMVp/Tyr-IRES2-EGFP质粒。采用酶切鉴定和测序鉴定验证我们所构建质粒的正确性。采用四质粒包装系统包装并浓缩病毒，测定病毒滴度和最佳感染MOI。慢病毒表达载体端粒酶靶向性检测以及MR成像的体外研究pLenti-hTERT/Tyr-IRES2-EGFP与pLenti-CMV/Tyr-IRES2-EGFP慢病毒分别体外感染端粒酶阳性HepG2、SGC7901、SW480细胞和端粒酶阴性U2OS细胞，共8株细胞，加上未感染病毒的对应的4株细胞，共12株细胞设定为靶细胞，其中CMV启动子感染的细胞为阳性对照组，hTERT启动子感染的端粒酶阴性细胞U2OS以及未感染的细胞为阴性对照组，hTERT启动子感染端粒酶阳性细胞为目标实验组。采用激光共聚焦观察各靶细胞EGFP的表达；采用RT-PCR检测各靶细胞中酪氨酸酶mRNA表达情况；采用WB检测各靶细胞中酪氨酸酶蛋白的表达情况；采用比色法检测各靶细胞490nm处吸光度值，测定各细胞的酪氨酸酶活性；采用Fontana染色检测各靶细胞中黑色素颗粒生成的情况；采用普鲁士蓝染色检测各靶细胞与铁离子按不同时间点共同孵育后，铁离子吸附情况随时间点变化而变化的情况；采用MR扫描检测各靶细胞与铁离子按不同时间点共同孵育后对细胞MR信号变化的影响。慢病毒表达载体对肿瘤MR特异性诊断的体内研究将分别感染了两种慢病毒的SGC7901和U2OS细胞接种于SCID小鼠右侧皮下，未感染慢病毒的对应细胞对称接种在SCID小鼠左侧皮下，制成荷瘤小鼠模型。采用3.0TMR扫描仪对小鼠进行扫描，观察CMV启动子和hTERT启动子肿瘤MR信号的变化；观察端粒酶阳性肿瘤和阴性肿瘤MR信号的变化；观察感染细胞和未感染细胞MR信号的变化，研究在hTERT启动子驱动下，MR报告基因酪氨酸酶基因对端粒酶阳性肿瘤MR定性诊断的可行性。并利用小动物荧光成像仪观察所有小鼠两侧肿瘤在体或离体下绿色荧光蛋白的表达情况；同时将肿瘤标本进行Fontana染色和普鲁士蓝染色，观察各肿瘤细胞内部黑色素颗粒的生成情况以及铁离子的吸附情况。三、结果1.pLenti-hTERT/Tyr-IRES2-EGFP与pLenti-CMV/Tyr-IRES2-EGFP慢病毒表达载体的构建及其包装酶切鉴定证实我们所构建的质粒中含有大小为1600bp的条带，与MR报告基因酪氨酸酶基因的理论大小相吻合；测序结果经与GENE BANK数据库进行比对，也证实构建的质粒中含有酪氨酸酶全长cDNA。提示已成功构建了hTERT/Tyr-IRES2-EGFP与CMV/Tyr-IRES2-EGFP质粒；经慢病毒4质粒系统包装后，检测其滴度达108数量级。2.慢病毒表达载体端粒酶靶向性检测以及MR成像的体外研究激光共聚焦显微镜结果显示在端粒酶阳性的肿瘤细胞中(SGC-7901胃癌细胞、HepG2肝癌细胞、SW480结肠癌细胞)，CMV和hTERT启动子慢病毒感染后均有EGFP的表达，而端粒酶阴性的U2OS骨肉瘤细胞只有CMV启动子慢病毒感染后有EGFP表达，hTERT启动子慢病毒感染后则没有EGFP的表达；RT-PCR和WB结果显示端粒酶阳性的上述细胞CMV和hTERT启动子病毒感染后均具有酪氨酸酶mRNA和蛋白的表达，而端粒酶阴性的细胞只有CMV启动子感染后的有酪氨酸酶mRNA和蛋白的表达，hTERT启动子病毒感染后则没有酪氨酸酶mRNA和蛋白的表达；A490结果显示端粒酶阳性的上述细胞CMV和hTERT启动子病毒感染后以及端粒酶阴性细胞CMV启动子感染后，细胞具有较强的酪氨酸酶活性，且显著高于端粒酶阴性细胞hTERT启动子病毒感染后的细胞以及未感染的细胞(p<0.01)；Fontana染色结果表明，具有酪氨酸酶活性的各株细胞胞浆内可见棕褐色银沉着颗粒，而没有酪氨酸酶活性的细胞内则缺乏此棕褐色颗粒；普鲁士蓝结果显示经与铁离子按不同时间点共同孵育后，具有酪氨酸酶活性的细胞内随着孵育时间的延长，细胞内可见大量蓝染的铁颗粒沉着，在36h-48h以后达到峰值，而没有酪氨酸酶活性的细胞内则仅见少量蓝染铁颗粒沉着，且随着时间的延长，沉着的铁颗粒未见明显增加；MR扫描结果显示，具有酪氨酸酶活性的细胞团其T1WI信号强度随着与铁离子孵育时间的延长而明显增加，且显著高于没有酪氨酸酶活性的细胞团(p<0.01)。3.慢病毒表达载体对不同肿瘤细胞MR分子影像诊断的体内研究体内试验结果显示SICD小鼠右侧感染CMV启动子慢病毒的端粒酶阳性肿瘤细胞SGC7901和端粒酶阴性肿瘤细胞U2OS在MR扫描T1WI像上信号强度明显高于左侧未感染病毒的SGC7901和U2OS细胞(p<0.05)；SCID小鼠右侧感染hTERT启动子病毒的端粒酶阴性肿瘤细胞U2OS在MR扫描T1WI像上信号强度与小鼠左侧未感染病毒的U2OS肿瘤细胞信号强度相似(p>0.05)，而小鼠右侧感染hTERT启动子的端粒酶阳性肿瘤细胞SGC7901在MR扫描T1WI像上信号强度明显高于左侧未感染病毒的SGC7901(p<0.05)；小动物荧光成像结果显示MR扫描信号增高的肿瘤均可见绿色荧光，MR扫描信号未增加的肿瘤则未见绿色荧光； Fontana染色结果显示所有MR信号增高的肿瘤标本中均有大量黑色颗粒沉着，提示有黑色素小体生成，而信号未增高的肿瘤标本中则未见黑色颗粒沉着；普鲁士蓝染色结果显示MR信号增高的肿瘤标本内部可见大量蓝染铁颗粒，而信号未增高的肿瘤标本中则仅见少量散在的蓝染铁颗粒沉着。四、结论1.在前期研究基础之上，成功改构了基于hTERT启动子的含有MR报告基因(酪氨酸酶基因)的端粒酶阳性肿瘤特异性诊断的慢病毒表达载体，体内外实验证实该病毒同样具有严格的端粒酶靶向性。2.该慢病毒表达载体感染端粒酶阳性细胞后，体内外实验均证实感染病毒细胞内具有较高的酪氨酸酶活性，且均能生成黑色素小体，吸附细胞周围的铁离子，使MRT1WI信号特异性升高。3.酪氨酸酶基因作为MR显像的报告基因在体内外实验中均是可行的，结合hTERT启动子的端粒酶特异性，为肿瘤的定性诊断提供了理论依据；同时为酪氨酸酶基因作为MR报告基因在临床的应用提供了理论依据。