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目的:基于血管新生在肝纤维化中的作用及miR-322与血管新生关系等研究进展，根据前期研究工作，本课题: 1、探讨miR-322/424调节血管新生参与肝纤维化作用机制。 2、揭示复肝丸调控miR-322/424的表达抗肝纤维化作用机制。 方法:本论文分为两个部分。 第一部分:miR-322/424在肝纤维化中的功能及作用机制研究 (1) CoCl2缺氧模型的建立:CCK8法检测氯化钴(CoCl2)对HHSEC细胞活力的影响，以CoCl2诱导HHSEC缺氧模型。 (2)体外研究:以CoCl2诱导HHSEC缺氧模型以miR-424mimic/inhibitor转染细胞，分别使miR-424过表达或表达受抑制，24h后，RT-PCR法检测细胞中miR-424表达;RT-PCR法和Western blot法检测HIF-1α、VCBCR复合体(Cul-2、Elongin B、Elongin C、VHL和RBX1)表达，观察细胞缺氧情况;用Transwell法观察细胞迁移变化;Matrigel体外管腔生成实验评价细胞管腔形成。RT-PCR法和Western blot法检测vWF、CD31、CD44表达，观察细胞表型的变化。明确miR-424在HHSEC缺氧损伤的作用及部分分子机制。 (3)体内研究:28只ICR雄性小鼠，随机分为正常组、正常+miR-322 agomir组、模型组、模型+miR-322 agomir组。采用15％CCl4腹腔注射的方法制备小鼠肝纤维化模型，每周3次，总共6周。自第4周始，miR-322 agomir组分别在第1、4、7、10、13、16、19天尾静脉注射50nmolmmu-miR-322-5p agomir。造模结束后，观察并记录小鼠的一般情况，包括体重、脾体比、肝体比变化;用试剂盒检测血清ALT、AST、T.Bil、ALB等肝功能指标;用苏木精-伊红(HE)染色法检测肝组织的炎性病理改变;天狼猩红染色观察肝组织胶原沉积，并对其纤维化等级进行半定量分析;盐酸水解法检测肝组织中羟脯氨酸(Hyp)含量变化;RT-PCR法检测肝组织miR-322表达;RT-PCR法和Western blot法检测HIF-1α、VCBCR复合体(Cul-2、Elongin B、Elongin C、VHL和RBX1)基因和蛋白表达，检测肝组织缺氧情况;免疫组化检测肝组织vWF、CD31、ColIV蛋白表达，分析微血管积分光密度(IOD)，根据蛋白和基因变化评价血管新生情况。 第二部分:复肝丸调控miR-322/424的表达抗肝纤维化的研究 (1)体外研究:CCK8检测复肝丸对HHSEC细胞活力的影响，确定其作用浓度;以CoCl2诱导HHSEC缺氧模型，复肝丸药物干预，并以miR-424 inhibitor为对照，24h后观察，用RT-PCR法检测细胞中miR-424表达;RT-PCR法和Westernblot法检测HIF-1α、VCBCR复合体(Cul-2、Elongin B、Elongin C、VHL和RBX1)基因和蛋白表达，观察肝细胞缺氧情况;用Transwell法观察细胞迁移变化;Matrigel体外管腔生成实验评价细胞管腔形成。RT-PCR法和Western blot法检测vWF、CD31、CD44表达，观察细胞表型的变化。 (2)体内研究:49只ICR雄性小鼠，随机分为正常组、模型组、miR-322antagomir组、复肝丸组。采用15％ CCl4腹腔注射的方法制备小鼠肝纤维化模型，每周3次，共6周。自第4周始，给予复肝丸组灌胃治疗（含生药10.7g/kg小鼠体重），每日1次，共3周;miR-322 antagomir组分别在第1、5、9、13、17、21天尾静脉注射100nmol mmu-miR-322-5p antagomir。造模结束后，观察并记录小鼠的一般情况，包括体重、脾体比、肝体比变化;用试剂盒检测血清ALT、AST、T.Bil、ALB等肝功能指标;用苏木精-伊红(HE)染色法检测肝组织的炎性病理改变;天狼猩红染色观察肝组织胶原沉积，并对其纤维化等级进行半定量分析;盐酸水解法检测肝组织中羟脯氨酸(Hyp)含量变化;RT-PCR法检测肝组织miR-322表达;RT-PCR法和Western blot法检测HIF-1α、VCBCR复合体(Cul-2、Elongin B、Elongin C、VHL和RBX1)基因和蛋白表达，检测肝组织缺氧情况;免疫组化检测肝组织vWF、CD31、ColIV蛋白表达，分析微血管积分光密度(IOD)，根据蛋白和基因变化评价血管新生情况。 结果: 第一部分 (1)建立CoCl2缺氧模型:50μM CoCl2诱导HHSEC细胞24小时缺氧模型的建立。与正常对照组比较，CoCl2模型组可促进细胞增殖活力、细胞迁移以及管腔的生成，可促进HIF-1α、vWF蛋白表达增加。 (2)体外研究:50nMmiR-424 mimic及100nM miR-424 inhibitor转染于HHSEC细胞转染效率高。转染24h后，与正常组比较，mimic组和模型组中miR-424表达均升高;Cul-2、Elongin B、Elongin C、VHL和RBX1等表达均降低;HIF-1α表达升高;促进了细胞增殖、细胞迁移以及管腔生成;vWF、CD31表达升高，CD44表达降低。与模型组比较，inhibitor组miR-424表达降低;Cul-2、Elongin B、ElonginC、VHL和RBX1等表达升高;HIF-1α表达降低;细胞增殖、细胞迁移以及管腔生成受抑制;vWF、CD31表达降低，CD44表达升高。 (3)体内研究:与正常组比较，N+miR-322激动剂组小鼠肝体比、脾体比无明显变化;肝功能指标ALT、ALB无明显变化，AST、T.Bil升高;Hyp含量无明显变化;肝组织炎性病理及胶原沉积无明显变化;miR-322表达增加;肝组织缺氧指标HIF-1α表达升高，Cul-2、Elongin B、Elongin C、VHL和RBX1等表达均降 低;肝脏血管新生指标vWF、CD31、ColIV表达升高，CD44表达降低。 与正常组比较，模型组小鼠肝体比明显增加，体重、脾体比无明显变化;ALT、AST、T.Bil、ALB等肝功能指标明显升高;Hyp含量明显增加;肝组织汇管区炎细胞浸润，肝细胞变性坏死;肝组织病理性胶原沉积增加;miR-322表达增加;肝组织缺氧指标HIF-1α表达升高，Cul-2、Elongin B、Elongin C、VHL和RBX1等表达均降低;肝脏血管新生指标vWF、CD31、ColIV表达升高，CD44表达降低。 与模型组比较，M+miR-322激动剂组小鼠体重肝体比、脾体比无明显变化;ALT、AST、T.Bil、ALB等肝功能指标无明显变化;Hyp含量明显增加;肝组织汇管区内大量炎细胞浸润，肝细胞变性坏死，可见桥接样结构;肝组织病理性胶原沉积明显加重;肝组织缺氧指标HIF-1α表达明显升高，Cul-2、Elongin B、ElonginC、VHL和RBX1等表达明显增加;肝脏血管新生指标vWF、CD31和ColIV表达升高，CD44表达降低。 第二部分 (1)体外研究:复肝丸浸膏作用于HHSEC的IC50为1602.1μg/mL。与正常组比较，200μg/mL、400μg/mL浓度的复肝丸对HHSEC细胞无明显毒性。药物作用于24h后，与正常组比较，模型组miR-424表达升高;Cul-2、Elongin B、ElonginC、VHL和RBX1等表达均降低;HIF-1α表达升高;促进细胞增殖、细胞迁移和管腔生成;vWF、CD31表达升高，CD44表达降低。与模型组比较，miR-424 inhibitor、和200μg/mL、400μg/mL浓度的复肝丸组miR-424表达均不同程度的降低;Cul-2、Elongin B、Elongin C、VHL和RBX1等表达升高，HIF-1α表达降低;细胞增殖、细胞迁移和管腔生成受抑制，vWF、CD31表达降低，CD44表达升高。 (2)体内研究:与正常组比较，模型组体重无明显变化，肝体比、脾体比显著增加;ALT、AST、T.Bil、ALB等肝功能指标明显升高，ALB水平无显变化;Hyp含量明显增加;肝组织汇管区炎细胞浸润，肝细胞变性坏死;肝组织病理性胶原沉积增加明显;miR-322表达增加;肝组织缺氧指标HIF-1α表达升高，Cul-2、Elongin B、Elongin C、VHL和RBX1等表达均降低;肝脏血管新生指标vWF、CD31、ColIV表达升高，CD44表达降低。 与模型组比较，复肝丸及miR-322拮抗剂组小鼠肝体比、脾体比、体重趋势均有降低，但无统计学差异;血清肝功能指标ALT、AST、T.Bil水平不同程度降低，ALB水平无显变化;肝组织炎细胞浸润减少，胶原沉积减少;miR-322表达降低;肝组织缺氧指标HIF-1α表达降低，Cul-2、Elongin B、Elongin C、VHL和RBX1等表达均增加;肝脏血管新生指标vWF、CD31和ColIV表达降低，CD44表达升高。 结论: 1、miR-322/424与肝纤维化密切相关，其作用机制与调控其靶基因Cul-2表达，上调HIF-1α活性，从而促进血管新生相关。 2、复肝丸具有良好的抗肝纤维化作用，其作用机制与抑制miR-322/424表达，抑制血管新生相关。