论文部分内容阅读
目的：①研究NOTCH信号通路受体（NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3）在浸润性膀胱癌组织和无瘤对照膀胱组织中的表达情况。②研究NOTCH信号通路的靶基因HES1及PTEN在浸润性膀胱癌组织和无瘤对照膀胱组织中的表达情况。③验证在人膀胱癌细胞T24中转染NOTCH1-ORF过表达质粒对NOTCH1基因表达上调的效果及对下游靶基因HES1、PTEN表达的影响。④研究在人膀胱癌细胞T24中外源性过表达NOTCH1基因对细胞的增殖能力和侵袭能力的影响。方法：运用荧光定量PCR和Western Blot技术，检测36例浸润性膀胱癌组织和10例无瘤对照膀胱组织中NOTCH1、2、3及HES1、PTEN的表达情况；在人膀胱癌细胞T24中转染NOTCH1-ORF过表达质粒，荧光定量PCR和Western Blot技术验证该质粒在T24细胞中对NOTCH1基因表达上调的效果并检测细胞中的靶基因HES1和PTEN在mRNA和蛋白质水平的表达改变；采用MTS法检测细胞的增殖情况，Transwell小室法检测细胞的侵袭能力。结果：①较之无瘤对照膀胱组织，浸润性膀胱癌组织中NOTCH1的表达明显上调，经荧光定量q-PCR分析：肿瘤组NOTCH1的△Ct值为1.01±0.08，对照组为3.06±0.49，以相对定量（2-△△Ct）计算，肿瘤组中NOTCH1的表达为对照组的4.22倍（P <0.05）。经Western Blot检测目的条带发现，肿瘤组的NOTCH1蛋白质表达强度明显高于对照组中的表达，经半定量分析两组的总灰度值分别为：肿瘤组282.18±36.5，对照组82.06±9.84（P <0.05）。NOTCH2、NOTCH3的表达在肿瘤组与对照组中均未见统计学差异（P>0.05）。②与对照组相比，浸润性膀胱癌组织中HES1和PTEN在mRNA和蛋白质水平的表达均有统计学差异（P <0.05）。荧光定量PCR检测显示，肿瘤组HES1的△Ct值为1.62±0.26，对照组为3.56±0.61，以相对定量（2-△△Ct）计算肿瘤组HES1为对照组的3.75倍（P <0.05）；肿瘤组中PTEN的表达则显著降低，为对照组的38.96%（P <0.05）。Western Blot检测目的条带显示，HES1在肿瘤组中呈高表达，其灰度值分别为：肿瘤组95.98±15.36，对照组为10.35±1.24；PTEN呈低表达，其灰度值分别为肿瘤组为12.98±1.12，对照组为47.85±3.78（P <0.05）。③转染NOTCH1-ORF过表达质粒的T24细胞，其NOTCH1基因在mRNA和蛋白质水平表达均升高，荧光定量PCR显示实验组细胞NOTCH1表达为对照组的14.03倍；在实验组细胞NOTCH1表达升高的同时，其HES1与PTEN的mRNA和蛋白质表达均明显改变，荧光定量PCR显示实验组细胞HES1的表达是对照组的5.43倍，而PTEN的表达为对照组的41.76%（P均<0.01）。Western Blot检测目的条带，其中NOTCH1灰度值分别为NOTCH1-ORF组为870.19±26.1，Empty-Vector组为123.35±3.08，T24-Control组为135.66±2.96；HES1对应的三组灰度值分别为146.14±5.84、34.82±1.36、31.70±0.98；PTEN对应的三组灰度值分别为74.51±2.06、128.73±2.61、和132.44±2.05（P均<0.01）。④起始数量相同的各组细胞，随着时间推移细胞数量均上升，但外源性过表达NOTCH1的实验组细胞其增殖程度明显高于另外两组对照细胞。于96小时对各组行细胞计数：NOTCH1-ORF组为（3.56±0.25）×10~4个，空载体对照组为（2.28±0.21）×10~4个，T24细胞对照组为（2.30±0.16）×10~4个，差异具有统计学意义（P <0.01）。使用Transwell小室法检测上述三组细胞，经计数统计，NOTCH1-ORF组的侵袭细胞数目显著多余另外两对照组细胞（P <0.05）。结论：浸润性膀胱癌中存在着NOTCH1、HES1和PTEN基因的异常表达。由NOTCH1的异常高表达所致的NOTCH信号通路激活是浸润性膀胱癌的分子事件之一，作为NOTCH信号通路指示剂的HES1的表达上调也证实了这一点。提示NOTCH1在浸润性膀胱癌中可能发挥癌基因的作用，并且活化的NOTCH1可能通过正性调节HES1的表达使信号下传继而负性调节抑癌基因PTEN的表达，最终促进肿瘤细胞增殖和侵袭，是浸润性膀胱癌的可能发病机制之一。