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研究背景Toll样受体（toll-like receptors,TLRs）是一类跨膜蛋白,最初从果蝇胚胎发育过程中被发现。哺乳类动物与果蝇的TLRs具有高度的同源性。TLRs的主要特征是细胞外富含亮氨酸的重复结构,是白介素-1受体（IL-1R）超家族的一员,在宿主的天然免疫应答中起哨兵样作用,在人的细胞中发现有十种表达亚型。不同亚型识别不同配子,启动各自的信号传导。Toll样受体4（toll-like receptor 4,TLR4）是TLRs中的一个亚型,它是在哺乳动物中最早被发现的与果蝇Toll受体高度同源的TLR。TLR4存在于机体的免疫细胞中,TLR4通过激活免疫细胞使机体产生内源或外源性免疫应答。在TLR4信号传导途径中,髓样细胞分化蛋白（MyD88）是TLR4下游的重要的衔接因子。在免疫反应中TLR4可通过MyD88依赖通路（MyD88-dependent）和非MyD88依赖通路（MyD88-independent）进行信号传导。Adam等的研究表明TLR4在胃癌、肝细胞癌、前列腺癌、淋巴瘤等多种恶性肿瘤细胞中表达,特别是TLR4的Asp299Gly基因多态性与肿瘤的发生发展高度相关。此外,TLR4在肿瘤细胞的凋亡过程中起重要作用。Fukata等的研究表明TLR4在人和小鼠的结肠肿瘤细胞中过表达,TLR4基因正常的小鼠（C3H/HeN mice）比TLR4基因敲除小鼠（C3H/HeJ mice）更易患结肠癌。Cianchi等研究发现,TLR4通过抑制凋亡增强了肿瘤细胞的免疫逃逸。Yusuf等研究证实:TLR4可以促进树突状细胞（DC）的成熟,从而增强肿瘤细胞的宿主免疫防御,在促癌因子7,12-二甲基苯并蒽（DMBA）的作用下,C3H/HeJ小鼠较C3H/HeN小鼠更易诱发皮肤癌。TLR4是把双刃剑,对不同组织中的致癌/抑癌作用使得TLR4成为非免疫学领域特别是肿瘤学领域中的研究热点。卵巢癌（ovarian cancer）是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤,严重威胁妇女的生命和健康。在卵巢恶性肿瘤中,近70%患者在确诊时已是进展期或已有转移。卵巢癌治疗的重要手段是手术治疗和以紫杉醇、铂类等为主的联合化疗。紫杉醇（Paclitaxel,Pac）是从太平洋紫杉属短叶（Taxus brevifolia）紫杉中提取的一种抗癌新药。Pac作用于β微管蛋白N端第31个氨基酸上,促进微管蛋白聚合并抑制其解聚,使细胞周期移行阻断在G2/M期,促使细胞死亡;美国的临床研究表明Pac对卵巢癌及乳腺癌有突出疗效,被誉为近15年来最好的抗肿瘤新药。Pac作为一线的化疗药物主要用于治疗卵巢癌,而肿瘤细胞对Pac耐药性的产生导致肿瘤的复发,使卵巢癌患者总的五年生存率仅为40%左右。文献报道在卵巢上皮癌组织及细胞系中,TLR4为阳性表达。研究表明:Pac与TLR4信号传导存在内在联系,Pac是TLR4的一个潜在配体。TLR4对卵巢癌细胞中Pac治疗作用的影响,Kelly等的研究显示:Pac启动TLR4/MyD88信号传导,激活了蛋白激酶C（Akt/PKC）,并进一步导致了NF-κB活化。TLR4通路的下游信号因子TAB1（TAK1-binding protein 1）可促进X连锁的凋亡抑制蛋白（XIAP）水平升高,而XIAP通过下调caspase-8表达而抑制TRAIL的凋亡途径。RNA干扰（RNA interference,RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA,dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。RNAi主要通过转录后水平阻断基因的表达,可以在研究基因的功能方面应用。同时可以通过关闭非必需或致病基因而改变人体的基因表达。哺乳动物中通过RNAi机制实现基因表达的抑制有多种策略,其中以构建小干扰RNA（small intereferenceRNA,siRNA）表达载体的方法最为稳定和持久。为此,寻找合适的靶基因进行RNAi,可以更细致的探讨肿瘤细胞复杂的生物学行为。本研究拟通过运用RNAi技术沉默TLR4基因的表达,探讨干扰TLR4后卵巢癌细胞对Pac敏感性的影响和发生机制,为提高Pac治疗卵巢癌的疗效寻找新途径,并为卵巢癌的临床治疗提供新的靶点。本研究分两部分:一、构建TLR4 shRNA表达质粒,稳定转染卵巢癌细胞并鉴定TLR4基因的沉默效果。二、探讨TLR4对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性影响的作用机制。第一部分RNAi表达载体的构建及沉默TLR4基因的效果鉴定研究目的:应用基因工程技术构建针对TLR4的shRNA真核表达载体并转染卵巢癌细胞,鉴定沉默TLR4基因的效果。研究方法:1.应用基因工程技术构建TLR4的shRNA真核表达载体（1）参阅已被文献证明有效的TLR4特异性siRNA序列:正义链为5’-CGATGATATTATTGACTTA-3’;反义链5′-TAAGTCAATAATATCATCG-3’。阴性对照选择与人类基因没有任何同源的干扰序列,正义链5’-GACTTCATAAGGCGCATGC-3’;反义链5’-GCATGCGCCTTATGAAGTC-3’。（2）siRNA插入模板的设计:根据TLR4siRNA设计针对其编码区的DNA寡核苷酸链,序列为:5′-GATCCCGATGATATTATTGACTTATTCAAGACGTAAGTCAATAATATCATCGTTTTTTGTCGACA-3’。以同样方式设计阴性对照引物,序列为:5’-GATCCGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACGGCATGCGCCTTATGAAGTCTTTTTTGTCGACA-3’。（3）载体与siRNA链连接:线性化质粒载体pGenesil-1与siRNA模板链连接,合成重组质粒分别命名为pGenesil-shTLR4（目的重组质粒）和pGenesil-shControl（阴性对照重组质粒）。（4）重组质粒的转化与提取:将重组体转化大肠杆菌DH5a,筛选卡那霉素（kanar）抗性的阳性克隆,提取质粒。（5）酶切鉴定及DNA测序:对构建的表达载体质粒pGenesil-shTLR4和pGenesil-shControl分别用SalI做酶切鉴定及DNA测序。2.重组质粒pGenesil-shTLR4、pGenesil-shControl分别转染SKOV3及A2780细胞,检测TLR4基因的沉默效果（1）采用脂质体（Lipofectamin）2000介导重组质粒pGenesil-shTLR4、pGenesil-shControl转染SKOV3、A2780细胞,G418筛选阳性克隆。（2）RT-PCR及Western blot检测稳定转染TLR4 shRNA质粒的SKOV3和A2780中TLR4和MyD88的mRNA及蛋白表达水平。结果:1.TLR4shRNA重组质粒载体酶切鉴定及DNA测序（1）构建的pGenesil-shTLR4和pGenesil-shControl的重组质粒,经琼脂糖凝胶电泳观察到被SalI酶切出一条约400bp的阳性带。pGenesil-shTLR4和pGenesil-shControl的重组质粒均符合设计要求。（2）重组质粒pGenesil-shTLR4和pGenesil-shControl的DNA测序结果通过DNAssist 2.2软件进行比对,与预先设计结果完全相符。2.TLR4基因的沉默效果鉴定（1）经G418筛选,4周后获得稳定转染pGenesil-shTLR4和pGenesil-shControl的SKOV3及A2780的阳性克隆。（2）RT-PCR,Westernblot检测结果表明:在亲代的SKOV3及A2780细胞中,TLR4在mRNA及蛋白水平均阳性表达,而MyD88在SKOV3中阳性表达（MyD88+）,在A2780中几乎不表达（MyD88-）;在目的质粒（pGenesil-shTLR4）转染卵巢癌细胞株SKOV3和A2780后,两种细胞中的TLR4mRNA及蛋白的表达水平较转染前均明显降低。结论:1.应用基因工程技术构建的重组质粒pGenesil-shTLR4和pGenesil-shControl,经酶切鉴定及DNA测序证实构建成功。2.pGenesil-shTLR4的质粒载体可以稳定的干扰卵巢癌细胞株SKOV3、A2780中TLR4基因的表达。第二部分TLR4对卵巢癌细胞紫杉醇敏感性影响的实验研究研究目的:1.检测卵巢癌细胞SKOV3、A2780中caspase3/7活性的表达、细胞生长抑制率、细胞周期的变化,观察干扰TLR4基因前后SKOV3、A2780细胞对紫杉醇作用敏感性的变化。2.检测SKOV3、A2780细胞凋亡通路中相关蛋白的表达水平,探讨干扰TLR4基因后卵巢癌细胞紫杉醇作用敏感性变化的相关发生机制。研究方法:1.采用Caspase-Glo 3/7荧光检测法检测紫杉醇作用24h后,转染目的质粒、阴性对照质粒的SKOV3细胞（SKOV3/shTLR4、SKOV3/shControl）及A2780细胞（A2780/shTLR4、A2780/shControl）中Caspase-3/7活性的表达。2.采用四甲基偶氮唑盐（Dimethylthiazol-2-yl-diphenyl tetrazalium bromide,MTT）法,检测紫杉醇对转染目的质粒、阴性对照质粒的SKOV3细胞（SKOV3/shTLR4、SKOV3/shControl）及A2780细胞（A2780/shTLR4、A2780/shControl）的生长抑制率（Growth inhibitory rate,GIR）的影响。3.流式细胞术（FCM）检测紫杉醇作用24h后,卵巢癌细胞SKOV3/shTLR4、SKOV3/shControl及A2780/shTLR4、A2780/shControl的细胞周期的分布情况。4.Western blot检测紫杉醇作用24h后,卵巢癌细胞SKOV3/shTLR4、SKOV3/shControl及A2780/shTLR4、A2780/shControl细胞中凋亡相关蛋白XIAP、Akt的表达。结果:1.紫杉醇对卵巢癌细胞SKOV3及A2780细胞Caspase-3/7活性的影响:紫杉醇作用24h后,TLR4基因沉默的SKOV3细胞（SKOV3/shTLR4）较阴性对照细胞（SKOV3/shControl）其Caspase-3/7的活性显著性升高（p＜0.001）;紫杉醇作用24h后,TLR4基因沉默的A2780细胞（A2780/shTLR4）较阴性对照细胞（A2780/shControl）其Caspase-3/7的活性无显著性变化（p=0.242）。2.紫杉醇对卵巢癌细胞SKOV3及A2780的生长抑制作用:在SKOV3/shTLR4细胞中,紫杉醇作用24h后,其生长抑制率（GIR）为59%,显著性高于未干扰组（29%）及阴性对照组（31%）（p＜0.001）;相同紫杉醇作用24h,A2780/shTLR4、为干扰组、阴性对照细胞三者生长抑制率（GIR）无显著性变化（p=0.054）。3.紫杉醇对卵巢癌细胞SKOV3及A2780细胞生长周期的影响:SKOV3/shTLR4细胞生长周期较阴性对照组（SKOV3/shControl）明显停滞于S期（p＜0.01）;相同作用下,A2780/shTLR4细胞生长周期较A2780/shControl细胞无显著性变化（p=0.06）。4.紫杉醇对卵巢癌细胞SKOV3及A2780细胞中凋亡相关蛋白表达的影响:在SKOV3/shTLR4细胞中,紫杉醇作用6h后pAkt的表达明显降低;12h后,XIAP的表达也出现明显降低。而A2780/shTLR4（MyD88阴性表达）细胞在紫杉醇作用的24h中pAkt、XIAP蛋白表达均无明显变化。结论:1.TLR4抑制紫杉醇对卵巢癌细胞SKOV3（MyD88阳性表达）的促凋亡作用,沉默TLR4的表达可以增强SKOV3细胞对紫杉醇的敏感性。2.TLR4基因的沉默可以抑制Akt的信号通路传导而促进SKOV3细胞的凋亡,增强SKOV3细胞对紫杉醇的敏感性。