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川芎为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根茎,是著名的川产道地药材,全国九成以上川芎产自四川。"山地育苓"与"平坝栽培"的川芎无性繁殖方式在四川已有近800～1000年的历史,也是川芎类药材生产中唯一采用该栽培模式的产地。在四川,未经过"山地育苓"的川芎往往较易感染病虫害,根茎发育不良引起产量显著降低。本研究在对川芎的品种源流、产地沿革、栽培模式等详实考证的基础上,采用多个体平行分析方法,利用PCR-DGGE、高通量测序、微生物纯培养等研究技术,跟踪调查了"山地育苓"和"平坝栽培"的生产循环过程中川芎内微生物的菌群结构变化规律,从微生态层面探究川芎"山地育苓"的科学内涵。主要研究成果如下:1.本研究通过对古典籍和本草学的查考,明晰了芎藭、藁本、蘼芜在唐以前均是同一基源植物藁本Ligusticum sinense Oliv.的不同入药部位。其中,蘼芜是幼嫩茎叶;芎劳为具膨大结节的根状茎,称马衔芎劳;藁本为块状的根状茎。唐代以后,芎劳为栽培藁本的块状根状茎,藁本为野生的根状茎。宋代,四川开始栽培芎劳,并以质优而闻名。至元代,由川产的道地药材川芎代替芎劳之名。在生产上,其独有的无性繁殖方式至少从《本草纲目》时代出现。一方面,川芎(芎劳)的功用部位存在从苗叶(蘼芜)到根上苗下的土苓子(马衔芎劳),再在到膨大根茎(雀脑芎)的变迁;另一方面,川芎由自然分布下的多产地来源演变为栽培条件下的"蜀川为胜",其中川产川芎特有的栽培技术起到了决定性的影响。2.川芎是多种微生物和植物组成的共生体。通过纯化培养获得可培养的川芎内生真菌14种38株、可培养的内生放线菌17种84株。通过PCR-DGGE分析技术显示出川芎在栽培各阶段有内生真菌、内生细菌各10～20多种;高通量测序显示在各阶段川芎内生真菌平均可达100多种,其中存在较多无法确定地位的类群。在川芎的共生体中,少数优势种在相对丰度上占绝对优势,而绝大多数的种类为相对丰度低于1%的稀有种。如粪壳菌纲Sordariomycetes在苓种期相对丰度约全部内生真菌类群的1/4,在平坝栽培阶段约占全部内生真菌类群的1/2。3.山地育苓前后的两次移栽,导致川芎共生体的微生态结构发生重组。PCR-DGGE与高通量测序分析显示,在圃芎期(平坝栽培)、苓种期(山地栽培)、药材采收期(平坝)这三个不同的栽培阶段,川芎内生菌群在OTU分布及相对丰度两个方面均发生了明显变化。一方面,山地育苓阶段具有比在平坝期更加丰富的内生真菌种类,如苓种阶段川芎内生真菌OTU平均130余条,圃芎期平均110条,药材期平均约90余条。多样性指数也呈现苓种期最高,药材期相对最低的变化趋势。说明不同的栽培环境对内生菌群的种类组成产生了明显的影响,尤以苓种期与另两个阶段之间川芎内生菌种类差异最大。另一方面,DGGE分析和高通量测序均显示,栽培过程中始终有一小部分内生菌群伴随川芎生长的各个阶段。真菌的OTU VENN图揭示这部分的恒定存在的真菌约占川芎生长全过程中内生真菌类群的10%左右,种类数约为50～60种。尤其相对丰度超过1%的约12个优势种,在川芎的各栽培阶段都存在。可见,川芎共生体中相对稳定的种类,在长期的适应进化中,与宿主形成了相对稳定的共生关系,在川芎栽培过程中可经苓子垂直传播进入下一代,是川芎微生态系统的重要组成部分。但这些可传播的类群,其相对丰度却随川芎栽培环境发生了变化。例如山地育苓期苓子中的优势类群赤霉菌属Gibberella、亡革菌属Thanatephorus、角担菌属Ceratobasidium、轮枝孢属Verticillium显著多于之后的平坝栽培阶段;粪壳菌纲Sordariomycetes unclassified、壳针孢属 Septoria、土赤壳属 Ilyonectria 等类群在平坝栽培期均显著多于山地苓种期。这些优势菌群相对丰度的显著变化与川芎栽培环境的变更相契合。说明,不同的栽培环境对恒定存在的内生菌群也产生了重要的影响。4.山地育苓通过对微生态结构重组调控川芎的生长发育与抗病能力。针对川芎主要病害——根腐病,本研究通过平板对峙实验,从苓种内分离筛选出6种具有拮抗病原菌作用的内生真菌和内生放线菌,分别为燕麦镰刀菌F.avenaceum、串珠镰刀菌胶孢变种F.moniliforme var.Subglutinans、淡紫拟青霉菌P.lilacinum,内生放线菌如深海链霉菌S.scopuliridis、灰锈赤链霉菌S.griseorubiginosus、团孢链霉菌S.Agglomeratus。同时,本研究通过测序发现苓种内存在比平坝栽培期更丰富是赤霉菌属Gibberella类群,在宿主健康平衡状态下,这些菌可能通过释放出适量的赤霉素类物质调控川芎地上部分的生长,促成苓种的形成,抑制地下部分生物量的过多积累,从而扩大种源数量。可见,通过山地育苓,川芎苓种获得了丰富的拮抗菌株,增加了有益微生物的种类和数量,通过与川芎内部其它潜在病原菌菌群间的微妙的抗衡,调控川芎的生长,增加了种源的产量,增强了苓种的抗病能力。5.山地育苓栽培引发微生态重组过程,影响川芎药用部位的形成和质量。通过主成分分析,发现3个不同育苓产地的川芎苓种之间内生菌群结构存在差异,栽培环境的不同是造成各苓种微生态结构差异最主要的因素。因此,不同的山地育苓环境,形成了不同内生菌群落结构特征的苓种。PCR-DGGE分析显示,苓种在某一环境中感染的一些新的内生菌株,可以在移栽至平坝后的圃芎期及药材采收期一直存在。同时,移栽回到坝区后,川芎也失去或减少一部分在山地感染的菌种,如赤霉菌属Gibberella的类群减少,可能导致地上部分的增高效应大大减弱,生物量更多地分配到地下部分,促进了根茎的膨大,增加药材产量。因此,本研究认为山地育苓过程造成的川芎微生态结构的重组所带来的影响是长效的,苓种期的内生菌群落结构不仅影响苓种株和苓子,对药材的产量和品质也产生了影响。综上所述,"山地育苓-平坝栽培"的川芎栽培模式在四川存在800～1 000年的悠久历史,是药农经过长期的栽培实践、探索、总结积累起来的宝贵种植经验,也是川芎道地性品质形成的技术保障。本研究首次从古典籍和本草学中考证了川芎的品种源流、产地沿革,以及栽培技术和药材功用部位变化对川芎药材地位形成产生的重大影响;从微生态的角度揭示了川芎"山地育苓-平坝栽培"这一传统种植技术的科学实质,是通过对川芎内生菌群落结构的重组,调控川芎苓种生物量的分布和促进地上部分的发育,增强苓种的抗病能力,进而促进和提高平坝栽培川芎的产量和质量,从而实现种源复壮。本研究以微生态学的原理阐释了药农朴素的农业智慧,为解释其他药用植物、农作物、苗木等的无性繁殖问题奠定了理论基础,为揭示植物内共生微生物对药材道地性的形成机制、药材的优良品质建成机理以及中药资源可持续利用及种质复壮等问题提供新的研究思路和方法。为进一步开发微生物菌剂如生物防治菌剂、微生物肥料等奠定了重要的基础,为其他植物发育过程中的微生态机制变化研究及微生物的利用与开发研究起到了示范作用。