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水稻不但是人类赖以生存的重要粮食作物，而且是单子叶植物中重要的模式植物。水稻颖花从外到内，依次由外稃、内稃、两个浆片、六枚雄蕊和一枚雌蕊组成。对水稻颖花发育机理的研究直接关系到水稻的产量和杂交育种工作，因此，一直是生物学家的研究热点之一。到目前为止，水稻花器官发育相关突变体有上百个，但是水稻颖花发育的基因遗传调控网络还少有报道。 本实验室借助水稻低温芯片，发现了一个低温应答基因，即OsGRF6。我们克隆了OsGRF6基因的全长cDNA，最后得到了该基因的三个反义表达株系。我们观察发现OsGRF6基因的反义表达植株在营养生长时期表现出了矮化的表型，而在生殖生长时期颖花的发育上呈现出花器官发育异常的表型，如内外稃片扣合异常及长护颖颖壳。我们对OsGRF6的反义植株花器官发育异常的表型很感兴趣。由于该OsGRF6基因是水稻中一个microRNA，OsmiR396d的靶基因，我们将OsmiR396d在野生型ZH10水稻中过表达后，发现过表达植株不仅在营养生长时期再现了OsGRF6反义植株矮化的表型，而且在生殖生长时期颖花的发育上也呈现出更加明显的颖壳扣合异常及长护颖的表型。OsmiR396d的靶基因OsGRF(Growth Regulating Factor)基因家族编码一类生长调节因子类的转录因子。通过组织表达模式分析，我们发现OsmiR396d的靶基因OsGRF类基因家族在水稻幼穗中均有较高的表达，其中OsGRF6和OsGRF10基因在幼穗中的表达尤为明显，这就暗示这两个基因可能在穗子发育中发挥着更加重要的作用。我们将OsGRF6过表达植株与OsmiR396d过表达水稻杂交后，OsmiR396d过表达株系矮化及颖花发育异常的表型得到了完全的恢复，这就表明OsmiR396d过表达转基因水稻花器官异常及矮化的表型确实是由于靶基因的表达下调引起的。grf6和grf10单突变体在花器官发育上没有明显的缺陷，这就暗示该类基因可能存在功能上的冗余。为了证明我们推测的OsGRF6和OsGRF10基因在幼穗发育中发挥着重要的作用，我们拿到了grf6/grf10双突纯合突变体。该grf6/grf10双突纯合突变体呈现出了一定比例的颖花扣合异常以及长护颖的表型，这就在一定程度上证实了我们的推测，说明OsGRF6和OsGRF10基因在幼穗发育过程中确实发挥着极其重要的作用。 为了阐明OsmiR396d过表达株系颖壳扣合异常、长护颖等表型产生的可能原因，我们在组织形态学以及分子生物学水平上进行了进一步的探索。首先我们对OsmiR396d过表达株系颖花进行了石蜡切片及扫描电镜的观察。我们发现在水稻颖花发育的早期，OsmiR396d过表达株系颖花就已呈现出异常花原基以及颖壳扣合异常的表型了。开颖，即开花，一般是由浆片吸水膨胀将内外稃片推开所导致的。，我们推测OsmiR396d过表达株系颖花扣合异常的表型可能是由于异常的花内器官，或者异常的细胞分裂导致内外稃片不能正常扣合而引起的。通过扫描电镜观察，我们发现OsmiR396d过表达株系颖花长护颖的表面结构已经不同于野生型护颖的表面结构，而是更加接近野生型内外稃片的表面结构。 为了在分子水平上阐明OsmiR396d过表达株系颖花异常的可能机理，我们对OsmiR396d过表达株系及其对应野生型水稻幼穗组织进行了基因表达谱的芯片分析。在该芯片中，我们发现了一个感兴趣的基因，即OsJMJ706基因，该基因在OsmiR396d过表达株系中表达下调。OsJMJ706基因编码一个H3K9去甲基化酶，据报道该基因的突变体花器官发育异常，我们对该突变体的观察发现该突变体也呈现出颖壳扣合异常及长护颖的表型。OsCR4基因编码一个类受体激酶，据报道该基因反义表达后产生明显的颖壳扣合异常表型，但是在芯片中没有检测到该基因。OsJMJ706和OsCR4基因均在OsmiR396d过表达株系中表达下调。通过EMSA、ChIP及荧光素酶活性实验，我们发现GRF类转录因子能够结合OsJMJ706以及OsCR4基因启动子区含有GARE元件的DNA序列，并激活它们的转录。通过遗传互补实验，我们将OsJMJ706基因在OsmiR396d过表达水稻中过表达后，只能部分恢复OsmiR396d过表达水稻颖花发育异常的表型，不能恢复矮化表型，这就暗示OsJMJ706基因在OsmiR396d介导的调控水稻颖花发育过程中发挥着重要的作用。 综上所述，本课题在分子水平和遗传水平上对水稻颖花颖壳扣合及长护颖产生的机制进行了探讨，初步得到了一个水稻颖壳发育的基因调控网络。以上研究结果将为科研人员在水稻颖花发育的分子调控上提供新的线索。