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诱导多功能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是胚胎发育研究、生产生物反应器、动物新品种以及动物抗病模型的研发等领域中的重要研究工具。在家畜动物的iPS重编程试验中，重编程效率低一直是影响iPS细胞应用的一个最大的难题。自从绿色荧光蛋白(Green Florescent Protein，GFP)报告基因的转基因小鼠诞生以后，多能性基因GFP报告基因在人和小鼠的重编程研究中的应用越来越多。目前，牛的诱导多功能干细胞的研究还很不成熟，借助牛多能性基因的报告体系诱导多功能细胞并建立细胞系的研究很少。OCT4(octamer-binding transcription factor4)和NANOG两个基因是多功能干细胞中重要的转录因子。Oct4是POU家族的一员，在胚胎干细胞和生殖干细胞中特定表达。NANOG是继OCT4之后，被发现的维持干细胞多能性必需的转录因子，只在胚胎干细胞中表达。Oct4和Nanog报告体系在人和小鼠多能干细胞分离、重编程诱导条件优化的研究中广泛应用。本实验借助牛OCT4和NANOG上游增强子调控GFP表达构建牛OCT4和NANOG报告体系，研究其上游调控区域在多能性干细胞中激活状态，对研究牛Na(i)ve状态干细胞分离培养、体细胞重编程Na(i)ve状态的多功能干细胞及胚胎发育具有重要作用。 本文的主要研究结果如下: 一、本研究以荷斯坦牛基因组DNA为模板分别克隆OCT4和NANOG的增强子片段，插入pGreenFire慢病毒载体，构建牛OCT4和NANOG的报告基因质粒bOCT4-GFP和bNANOG-GFP。将报告基因质粒包装入慢病毒后，分别感染Na(i)ve状态的小鼠胚胎干细胞和Prime状态的人胚胎干细胞，对报告体系进行功能检测。结果表明，被感染的细胞均表达GFP，说明构建的报告基因质粒成功在干细胞中行使指示作用。随后将GFP阳性的小鼠胚胎干细胞进行胚胎体（Embryoid Body，EB）分化，检测报告基因是否在干细胞分化时沉默。通过流式细胞仪和实时定量PCR分别对EB细胞的荧光强度和多能性基因检测发现，内源基因OCT4在干细胞分化过程中表达量减少，报告基因的荧光强度也随之减弱，表明牛OCT4和NANOG报告体系是由多功能干细胞内源性基因激活，在Na(i)ve和Prime状态的干细胞中都能够成功表达，并能实时监控干细胞的多能性，为后续进一步研究牛OCT4增强子区域打下基础。 二、OCT4基因在多能性细胞中的表达主要由远端增强子(Distal Enhancer,DE)和近端增强子(Proximal Enhancer,PE)调控。为了探究牛OCT4增强子在多能性细胞中对OCT4基因的调控机制。以荷斯坦牛基因组DNA为模板分别克隆OCT4的远端增强子和近端增强子片段，结合pGreenFire慢病毒载体分别构建了只含有牛OCT4远端增强子或近端增强子的报告基因质粒bOCT4-DE-GFP、bOCT4-DE2-GFP和bOCT4-PE-GFP。将报告基因质粒包装为慢病毒后感染小鼠胚胎干细胞，只在感染了bOCT4-DE-GFP和bOCT4-DE2-GFP病毒的细胞中检测到绿色荧光蛋白，其中bOCT4-DE-GFP质粒感染的细胞中荧光强度最高。将GFP阳性的小鼠胚胎干细胞向Prime状态诱导后，细胞的绿色荧光消失。然后将Prime时期的干细胞诱导回Na(i)ve状态的干细胞后，细胞重新表达绿色荧光蛋白。以上结果表明，牛OCT4近端增强子在Na(i)ve状态的干细胞中没有活性，远端增强子只在Na(i)ve状态的干细胞中处于激活状态，其中bOCT4-DE-GFP质粒最适合指示在Na(i)ve状态的干细胞中OCT4的表达。最后，通过EB诱导分化试验证明，报告基因的荧光强度随着OCT4的表达量逐渐下降而减弱。该部分研究构建了只含有牛OCT4远端增强子或者近端增强子的牛OCT4报告基因质粒，通过检测小鼠胚胎干细胞Na(i)ve与Prime状态转换中的GFP表达情况，证实构建的牛OCT4报告基因可用于牛Na(i)ve状态干细胞的分离、培养和诱导Na(i)ve状态的牛iPSCs等研究。 三、为了检测报告基因质粒在重编程过程中的表达情况。将构建的报告基因质粒bOCT4-GFP、bOCT4-DE-GFP和bOCT4-DE2-GFP应用于小鼠成纤维细胞重编程实验中。重编程一周后得到表达GFP的类iPSCs细胞。去除诱导表达重编程因子的多西环素(doxycycline，Dox)，将外源重编程因子沉默，并将细胞转移到2i/mLif培养基中继续培养，细胞生长良好并继续表达GFP。实时定量PCR检测其多能性基因的表达程度达到干细胞水平，说明得到了完成重编程的Na(i)ve状态iPS细胞。得到的iPS细胞能够持续表达GFP，说明GFP是由细胞内源OCT4激活。构建的OCT4报告基因质粒可在细胞重编程实验中起到有效的指示作用，为后续成功诱导出牛Na(i)ve状态的iPSCs以及iPSCs的应用提供一个有用的工具。 综上所述，本实验成功构建了牛OCT4和NANOG的绿色荧光报告体系，并首次应用在不同状态的多能性细胞中。同时证实了牛OCT4基因的远端增强子在Na(i)ve状态的多能性细胞中具有活性。将OCT4的报告基因应用在小鼠重编程实验中，成功指示出重编程完成的细胞。该报告体系为牛Na(i)ve状态干细胞的分离培养和诱导Na(i)ve状态的牛iPSCs等研究提供重要的研究工具。