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弓形虫SAG1基因所编码的蛋白为弓形虫主要表面抗原P30,其约占速殖子总蛋白量的5%,P30对侵入宿主细胞及其毒力具有重要性,并具有高度免疫原性和免疫保护性,因而成为弓形虫病疫苗和检测的研究重点。
通过制备并分析弓形虫抗原蛋白,以此抗原制备高效价的兔抗弓形虫多克隆抗体,为弓形虫的免疫检测和诊断提供有效的方法和途径,同时也为基因工程产物的鉴定提供方便有效的检测手段。速殖子主要来源于感染后72—74 h获得的腹水,通过常规方法制备和提纯弓形虫可溶性抗原,以抗原和福氏佐剂制备成完全和不完全福氏佐剂通过脊柱两旁皮下多点免疫的途径免疫新西兰大白兔,制备兔抗弓形体多克隆抗体,间接ELISA法检测血清中抗体的效价。结果兔抗弓形体抗体效价在60,000以上。
根据已知的SAG1基因序列,设计引物,以弓形虫速殖子总DNA为模板,PCR扩增出p30基因,再将片段构建到原核表达载体pGEX—6P—1中,经抗性筛选,以及PCR、双酶切鉴定,挑选出阳性克隆子进行测序,结果表明成功构建了原核表达重组载体pGEX—P30。将重组载体pGEX—P30转化宿主菌BL21(DE3)中,用异丙基—β—D—半乳糖(IPTG)诱导表达目的蛋白。SDS—PAGE分析表达的蛋白,结果发现在预期目的蛋白大小约为54 KD处有特异的条带,用凝胶成像软件分析其表达量为54.0%。Western—blotting结果显示,经IPTG诱导后的细菌产生的可溶与包涵体形式表达的的融合蛋白均可与抗弓形虫的多克隆抗体特异结合。
将纯化后的P30抗原与佐剂混合乳化后,注射免疫小鼠,经过27天,用间接酶联免疫吸附(ELISA)的方法测得抗体效价超过1:12800。再用弓形虫滋养体感染免疫过的和对照的小鼠,结果显示免疫过的小鼠存活时间明显比对照组长,说明P30抗原能激发小鼠体液免疫,对弓形体感染具有一定的保护性。之后,为了证明纯化后的P30能否用来做检测试剂的可行性,我们用P30包被酶标版,用ELISA的方法检测感染组、免疫阳性对照组和阴性对照组的小鼠的血清,结果显示感染组和阳性对照组的抗体滴度明显大于阴性对照组。为了进一步证实,我们还用Western印迹法验证了P30抗原和受弓形虫感染的小鼠的血清中抗体存在特异的反应。
本实验用原核表达载体pGEX—6P—1高效表达了弓形虫速殖子表膜蛋白P30,并证实了纯化后的P30有很好的生物活性,小鼠试验显示了P30具有一定的免疫保护性,而且能特异的检测被感染小鼠的血清中的抗体,为研究弓形虫重组疫苗和弓形虫病的检测方法提供了一定的基础。