【摘 要】
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目的:全球疟疾发生率和致死率严峻,传统的抗疟药物已不足以起到防治作用。青蒿素是抗疟疾使用最广泛的化合物,在全世界范围内的疟疾治疗中起着关键作用。PfNIF4蛋白是一种恶性疟原虫NLI相互作用样蛋白磷酸酶,其与FCP/SCP家族成员均具有催化RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ,RNAPⅡ）的羧基末端结构域（carboxy-terminal domain,CTD）的“DxDx（T/V）”基
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目的:全球疟疾发生率和致死率严峻,传统的抗疟药物已不足以起到防治作用。青蒿素是抗疟疾使用最广泛的化合物,在全世界范围内的疟疾治疗中起着关键作用。PfNIF4蛋白是一种恶性疟原虫NLI相互作用样蛋白磷酸酶,其与FCP/SCP家族成员均具有催化RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ,RNAPⅡ）的羧基末端结构域（carboxy-terminal domain,CTD）的“DxDx（T/V）”基序,且参与调控RNA转录。近年来RNAPⅡ参与调控var基因的转录机制已成为恶性疟原虫逃避宿主免疫的研究热点。同时,全基因组关联分析发现PfNIF4蛋白的Y1133N和V1157L位点突变与青蒿素抗药性高度相关。鉴于PfNIF4蛋白在恶性疟原虫生长发育及其青蒿素抗药性中的潜在作用,本研究拟通过分子生物学方法检测PfNIF4蛋白在疟原虫生长周期中的的表达和定位,以及在疟原虫红内期生长发育中的作用机制,并初步探讨PfNIF4蛋白与青蒿素抗药的相关性,以期为疟疾防治提供新的作用靶点。方法:本研究采用生物信息学分析,预测PfNIF4蛋白的结构、功能及其红内期定位情况。采用间接免疫荧光及免疫印迹技术检测PfNIF4蛋白在红内期和配子体阶段的定位与表达情况。采用CRISPR-Cas9及Glm S riboswitch技术构建PfNIF4蛋白敲减虫株(NIF4 inducible knockdown strain,NIF4iKD)。通过敲减PfNIF4蛋白,评估恶性疟原虫红内期生长发育,增值率,裂殖体侵袭和配子体发育情况。采用Quantitative RT-PCR鉴定PfNIF4蛋白敲减后,侵袭相关基因表达水平的变化。通过使用磷酸化抗体,检测PfNIF4蛋白敲减后,RNAPⅡ蛋白CTD结构域中七肽重复序列“YSPTSPK”第2和5位点（Ser2/5）磷酸化水平的改变。通过IC50方法检测,PfNIF4蛋白敲减后,疟原虫对双氢青蒿素（dihydroartemisinin,DHA）,青蒿琥酯（artesunate,AS）,蒿甲醚（artemether,AM）和甲氟喹（mefloquine,MFQ）的药物敏感性变化。实验数据采用Prism进行分析,P>0.05具有统计学意义。结果:1、生物信息学分析发现PfNIF4属于FCP/SCP家族成员,具有保守的CPDc结构域（catalytic domain of ctd-like phosphatases,CPDc）,且包含“DxDx（T/V）”基序。蛋白定位预测显示:PfNIF4蛋白定位于疟原虫的细胞核和/或细胞浆中。2、基因型PCR和Western blot实验结果提示,成功构建并筛选出NIF4iKD#C6虫株。Western blot实验结果显示PfNIF4蛋白在红内期和配子体阶段均有表达,且在裂殖体阶段表达水平达峰值。IFA显示:PfNIF4蛋白在红内期阶段定位于恶性疟原虫的细胞核（Pearson’s相关系数,0.49-0.66）,在雄配子体阶段定位于细胞浆（Pearson’s相关系数,0.07）。3、采用2.5 m M GLcN处理NIF4iKD#C6,可以显著降低PfNIF4蛋白表达水平（P<0.01）。红内期表型分析显示,PfNIF4蛋白敲减时,其在红内期原虫血症下降约35%。当PfNIF4蛋白表达量降低时,恶性疟原虫的红内期生长发育受到抑制,增值率由8.78±1.05降至5±1,其环状体生成量从5.99%±0.72%IEs降至2.55%±0.46%IEs。4、PfNIF4蛋白敲减时,配子体生成率在第6天开始下降（P<0.05）,但雄/雌配子体比率不变。5、当PfNIF4蛋白表达量下降时,参与裂殖子侵袭相关基因ron2、ron4、ron5、ron6、ron12、ama1、rhoph2、rhoph3、msp4、msa180和eba175下调。6、PfNIF4蛋白敲减上调七肽重复序列“YSPTSPK”中Ser2/5磷酸化水平约1.2倍。7、当PfNIF4蛋白敲减时,疟原虫对4种青蒿素相关药物敏感性显著上调。结论:1、PfNIF4蛋白与FCP/SCP家族成员均具有“DxDx（T/V）”基序。2、PfNIF4蛋白在环状体、滋养体、裂殖体和配子体阶段均有表达,且主要定位在疟原虫的细胞核中。3、PfNIF4蛋白表达下调对疟原虫增值具有一定的抑制作用,并且上调了对抗疟药物的敏感性,其机制与参与侵袭相关基因的转录水平及其磷酸化RNAPⅡ的CTD水平有关。
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