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研究背景:
钾离子通道是心肌细胞动作电位形成的重要组成部分,是抗心律失常药物作用的靶点。小电导钙离子激活钾离子通道(small-conductancecalcium-activated potassium channels SK,KCa2)就是其中的一类,SK通道几乎存在于所有可兴奋细胞中,是通过钙离子浓度升高而激活的钾离子通道。SK通道动力学和Ca2+的剂量反应研究揭示SK通道对Ca2+具有高度敏感性,并对Ca2+反应极为迅速。SKY通道的激活是通过Ca2+连接到钙调蛋白上诱导构象的变化导致通道的开放。在哺乳类动物中,SK通道主要有3种亚型:分别为SK1、SK2、SK3通道。SK通道,尤其是SK2通道在人类和小鼠的心肌细胞的动作电位去极化中起着功能性作用。
在心脏中,Ca2+作用到钙离子敏感性作用分子上主要通过两种途径:一是通过细胞膜上的电压门控性钙离子通道(Voltage-dependent calcium channels,VGCCs)；二是通过位于肌浆网(sarcoplasmic reticulum,SR)上的兰尼碱受体(ryanodine receptors,RyRs)触发内质网Ca2+释放从而激活SK通道。RyRs是一种钙离子敏感性钙诱发钙释放(calcium-induced calcium release,CICR)的钙离子释放通道。研究表明,在心肌动作电位形成中SK通道的激活主要是通过L-型钙离子通道激活。RyR的开放可以产生钙离子浓度瞬间增加从而能够作用于细胞膜上的离子通道。那么,心肌细胞产生动作电位时,心肌细胞内的Ca2+是否可通过RyR2受体诱导Ca2+释放而激活SK2通道?目前国内外尚未见相关报道。本实验旨在探讨在天然组织中RyR2和SK2通道的相互作用,研究SK2通道作用的分子机理,为近年来探讨SK通道的生理功能及其与心律失常发生机制关系的研究奠定坚实的理论基础,为临床心律失常药物作用的靶点提供新思路。
材料方法:
1.本实验采用成熟(16-22 W)的C5781/6J小鼠,体重20-25 g,雌雄各半,购买于上海实验动物中心。
2.抗体、试剂:兔源多克隆抗-SK2抗体(Alomone Labs),小鼠多克隆抗RyR2抗体(Affinity BioReagents),HRP山羊抗兔/抗鼠IgG抗体(PTERCE),FITC山羊抗小鼠IgG抗体(中杉金桥),TEXRED山羊抗小鼠IgG抗体(中山金桥)。Western Blot中抗体为TBST稀释,免疫化学荧光标记中抗体稀释为抗体稀释液100 ml PBS,1 g BSA,0.05 g Na2N3稀释。相关试剂有:protein G-Plusagarose(Santa Cruz Biotechnology)、荧光防淬灭剂(SouthernBiotech),牛血清白蛋白(BSA,Sigma),蛋白预染marker(Fermentas),ECL化学发光试剂(USA Thermo).Cocktail蛋白酶抑制剂(Roche Diagnostics)。
3.Western Blot:分别分离C57BL/6J小鼠的心房及心室组织及大脑组织,以组织裂解液裂解组织,提取目的蛋白。其中脑组织作为阳性对照。样品蛋白裂解液经6％SDS-PAGE或8％SDS-PAGE凝胶电泳后通过湿转法转迹于PVDF膜,随后PVDF膜用特异性兔源多克隆抗-SK2(1:200)抗体、小鼠单克隆抗-RyR2抗体(1:600)孵育,4℃过夜。二抗为辣根过氧化物酶标记的HRP-山羊抗小鼠IgG、HRP-山羊抗兔IgG,ECL化学发光,曝光显影检测目的蛋白。
4.免疫共沉淀:小鼠心房肌组织中加入IP蛋白裂解液(50 mM Tris-HCl,200mMNaCl,20 mM NaF,1 mM Na3VO4,0.5％Triton X-100 and complete proteaseinhibitor cocktail,pH7.4),全细胞裂解液中分别加入小鼠单克隆抗RyR2抗体和兔多克隆抗SK2抗体,阴性对照用小鼠源和兔源无关抗IgG抗体,4℃孵育过夜(大于12小时),加入PrteinG-Sepharose4℃孵育6 h。免疫复合物经高盐、低盐、无盐IP buffer洗兑后9000 rpm离心,取管底免疫复合物,在免疫沉淀复合物中加入上样缓冲液,70℃煮样10 min,用6％或8％SDS-PAGE凝胶电泳后,印迹于PVDF膜上。分别用兔多克隆抗SK2抗体和小鼠单克隆抗RyR2抗体进行Western Blot检测。
5.免疫细胞化学:将小鼠心脏经主动脉根部逆行插管后置于Langendorff装置上进行恒温恒速灌流,Ⅱ型胶原酶消化分离小鼠心肌获得单个心肌细胞。4％多聚甲醛固定新鲜心肌细胞30 min,0.3％Triton X-100穿膜10min,双重免疫细胞化学标记。兔多克隆抗SK2抗体(1:50)+小鼠单克隆抗RyR2抗体(1:200),4℃孵育过夜。二抗为FITC-羊抗鼠IgG(1:100)和TEXRED-羊抗兔IgG(1:100)室温孵育2 hrs。荧光防淬灭剂封片,激光共聚焦显微镜(Japan,Olympus FV1000)观察SK2通道与RyR2的免疫阳性反应。
结果：
1.小鼠心肌组织中表达SK2通道和RyR2。
2.小鼠心肌组织中SK2通道和RyR2间能够相互形成免疫共沉淀复合物,提示SK2通道与RyR2间存在相互作用。
3.小鼠心肌细胞上SK2通道与RyR2定位于细胞膜,RyR2沿T管膜分布,SK2通道部分沿T管膜分布。
小结:
本研究初步证实了小鼠心房肌细胞天然表达的SK2通道和RyR2之间存在着相互作用；并且在小鼠心房肌细胞T管膜上存在部分共定位。