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近年来,手足口病在世界多个地区,尤其是亚洲爆发并流行,且其感染和死亡率逐年增高,危害十分严重。肠道病毒71(Enterovirus71, EV71)是手足口病(Hand, foot, and mouth disease, HFMD)的主要病原体,以感染婴幼儿为主,其感染常伴随神经系统并发症,严重可导致儿童死亡。因此,EV71的分子生物学研究,预防及治疗EV71感染的药物开发,已成为当前病毒学研究领域的热点。miRNAs是在真核生物中发现的一类内源性长度约为22个核苷酸单链非编码RNA,通过降解靶mRNA分子或抑制靶基因mRNA的翻译,参与转录后基因表达的调控过程。已经证实miRNAs在很多生物学过程中起着重要的作用,越来越多的研究表明miRNAs还参与调控病毒在宿主细胞内的感染和复制过程,本文对miRNAs在宿主细胞内调控EV71病毒的复制的作用进行了研究。首先构建了miRNAs靶基因筛选系统。我们在Luciferase双检测体系的pMIR载体插入待检基因,如果插入的基因序列能被细胞内的miRNAs靶向调控,报告基因的表达将发生变化。通过实验,我们发现插入EV71病毒5’-UTR基因的pMIR载体,报告基因的表达下降了2.5倍左右。进一步将5’-UTR基因打断成260bp左右的片段,同样进行检测,发现5’-UTR-1(1-270)片段使Luciferase的表达下降了2.5倍左右,所以推测5’-UTR-1片段可能是miRNAs的作用靶标。随后我们利用在线分析软件,预测可能作用于5’-UTR-1基因片段的1niRNAs,选择其中的miR-373和miR-542-5p合成minics,检测niRNAs对5’-UTR-1基因片段的作用,结果显示,二者都可以下调报告基因的表达。但miRNAs分子对5’-UTR-1基因的调控作用是否可以体现在EV71病毒的复制过程中?为此,我们选择了miR-373和miR-542-5p做了进一步研究。我们在RD细胞中转染miRNAs minics,6h后感染EV71病毒。利用Western blot和real-time PCR实验检验病毒的复制情况。结果显示,miR-373和miR-542-5p可以抑制EV71病毒在RD细胞中的复制。但是miR-373和miR-542-5p的具体作用机制还有待进一步研究。本论文的另一部分内容是进行抗EV71病毒复制的先导化合物的筛选。新药的发现路径大致为化合物库的合成和靶的开发,高通量的筛选,选出有希望的先导化合物,接下来进行先导化合物的最优化,临床实验直到新药的上市。本实验由武汉大学提供6种化学合成的医药中间体,3,4-二甲氧基苯甲酸甲酯(Methyl3,4-dimethoxybenzoate),3,4-二甲氧基苯乙酸甲酯(Methyl3,4-dimethoxyphenylacetate),D-对羟基苯甘氨酸甲酯(Methyl D-(-)-4-hydroxy-phenylglycinate),4-氯苯甘氨酸((R)-4-Chlorophenyl glycine),3,4-二羟基苯乙酸甲酯(Methyl3,4-dihydroxyphenylacetatate),4-氯-2-异丙基-5-甲苯酚(4-Chloro-5-methyl-2-(1-methylethyl)-phenol)以及2种五肽化合物—P010157和P010158。首先通过Western blot进行筛选,发现3,4-二羟基苯乙酸甲酯对EV71在RD细胞中的复制具有明显的抑制效果。接下来利用MTT法初步检测3,4-二羟基苯乙酸甲酯的细胞毒性,结果表明CC50为0.0726μg/μL,细胞毒性较低。Real-time PCR检验3,4-二羟基苯乙酸甲酯对EV71病毒复制的影响,当终浓度为0.01μg/μL时对EV71病毒复制的抑制率为76.83+2.47%。以上结果表明3,4-二羟基苯乙酸甲酯对EV71病毒在RD细胞中的复制具有抑制作用。感染EV71病毒的一日龄ICR乳鼠注射3,4-二羟基苯乙酸甲酯,生长状态明显好于阳性对照组,real-time PCR检测3,4-二羟基苯乙酸甲酯对EV71病毒在乳鼠体内的复制具有很好的抑制效果。以上结果证明3,4-二羟基苯乙酸甲酯是一种具有开发潜力的抗EV71病毒复制药物,但具体的作用机制还有待进一步研究,并且还需要根据EV71病毒的基因组特点,优化3,4-二羟基苯乙酸甲酯的结构,合成效果更好的衍生物。采用同样的思路对比2种五肽化合物的实验结果,Western blot发现P010157能够抑制EV71病毒在RD细胞中的复制,CC50大约可达到155.7378μg/μL。Real-time PCR结果显示,当P010157终浓度为0.1μg/μL时对EV71病毒复制的抑制率为91.84+2.04%。以上结果说明P010157具有很好的开发价值。本文从miRNAs和小分子化合物两方面研究了它们对EV71病毒在宿主细胞中复制的调控作用,有了初步的研究结果,为利用1miRNAs和小分子化合物抑制EV71病毒复制的相关研究提供了有价值的参考。