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肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,以下简称肝癌或HCC)占原发性肝癌90%以上，发病率在全球恶性肿瘤中居第六位，死亡率居第四位，是预后最差的恶性肿瘤之一。我国是肝癌高发区，乙肝病毒感染是我国肝癌的主要病因。近年来，随着乙肝携带者、肝硬化等肝癌高危人群筛查的普及，使更多的早期肝癌得以发现，而且肝癌的治疗手段也从过去单一的手术切除，发展到以手术为主，联合消融治疗、介入治疗以及分子靶向治疗的综合治疗，从而使得肝癌的治疗效果有了显著提高。但肝癌切除术后复发、转移率相当高，使得肝癌患者的预后仍较差，即使是早期肝癌，术后仍易发生复发转移，长期生存结果仍然不能令人满意。
肿瘤的增殖、侵袭性生长以及转移是恶性肿瘤治疗困难的根本原因。目前常规的治疗手段难以从根本上完全清除恶性肿瘤细胞，因此，从分子水平揭示恶性肿瘤增殖、侵袭、转移的关键机制，建立起一套行之有效的治疗策略尤为重要，也是根治肿瘤的希望所在。近年来，一系列分子靶向药物应用于恶性肿瘤的治疗，受到了广泛关注。
调节因子X(Regulatory factors that bind to the X box，RFX)是一大类在进化上保守、而结构上含有76个高度保守的氨基酸序列的DNA结合域(DBD)、呈现翼状螺旋结构的蛋白质，可以结合在目的基因启动子或基因间区、内含子、外显子等基序上的保守的13-15个DNA碱基对的顺式调控元件X-box。在哺乳动物中陆续发现有7种RFX(RFX1～7)存在。RFXl是最早发现的家族成员，与神经系统的发育和功能形成密切相关，通过与靶基因上游的RFXl结合序列结合调控靶基因的表达，具有双重调控功能。RFX1与c-myc、PCNA及MAP1A基因上游结合位点为负性调控元件，RFX1抑制上述基因表达。相反，RFX1可以作为乙肝病毒增强子Ⅰ的转录因子激活乙肝病毒的复制与表达。
RFX1与肿瘤的发生、发展有着密切的关系，研究表明RFX1在人类恶性胶质瘤中的表达下调，上调恶性胶质瘤中RFX1的表达可以抑制肿瘤细胞的增殖，提示RFX1参与了胶质瘤的发生、发展；最新研究表明过表达RFXl可以下调CD44的表达，从而抑制胶质瘤的侵袭性；Feng等的研究也证实在神经母细胞瘤中过表达RFXl可以下调转化生长因子β2(transforminggrowthfactor-β2，TGFβ2)的表达，抑制肿瘤细胞的增殖。而Watts等通过研究发现RFX1在Barret食管癌变的过程中表达逐渐下降，提示RFX1可能参与了食管癌的发生、发展。最新的研究发现，RFX1可以通过激活酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制肝癌细胞的增殖，在肝癌中发挥了抑癌基因的功能。那么RFX1在肝癌组织中的表达有无异常，是否可以可以作为预测肝癌患者预后的分子指标，是否影响肝癌的侵袭转移及分子机制？这些问题的解决将有助于加深对肝癌生物学特征的理解和寻找更加有效的新型抑癌策略。
第一部分：RFX1在肝癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系
研究背景：
肝癌作为我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率居第4位，死亡率居第3位。近年来，随着更多的小肝癌患者被发现以及消融治疗、介入治疗及分子靶向治疗等治疗手段的进展，肝癌治疗效果有了很大的提高。但是，肝癌切除术后复发、转移率高，即使是小肝癌，根治性切除术后，仍有60%的患者发生复发、转移，使得肝癌患者的总生存仍然不容乐观。
目前临床上仍采用临床病理因素，如肿瘤大小、数目、血管侵犯来预测肝癌患者的预后。但是，这些预测指标难以预测小肝癌的预后。因此，寻找可以预测肝癌尤其是小肝癌患者预后的分子指标，有助于更好地发现高危复发风险的肝癌患者，从而采取个体化的治疗方案，提高患者的长期生存率。
研究显示，在多种恶性肿瘤中RFX1的表达下调，然而，目前尚无RFX1在肝癌组织中的表达及其对预后的预测价值的研究。
目的：
通过检测RFX1蛋白在肝癌组织及配对癌旁肝组织中的表达情况，分析RFX1表达与肝癌患者临床病理学特征及预后的关系，探讨RFX1在肝癌预后预测中的临床意义。
方法：
采用免疫组织化学(Immunohistochemical，IHC)方法检测221例肝癌(其中小肝癌97例)石蜡包埋癌组织及配对癌旁肝组织，另外检测71例小肝癌组织中RFX1蛋白的表达，分析肝癌组织中RFX1表达与肝癌患者临床病理特征及总生存期(Overall survival，OS)及复发时间(Time to recurrence, TTR)的关系。
结果：
(1)46.1%(102/211)的肝癌组织中RFX1高表达，显著低于癌旁肝组织中92.4%(195/211)的RFX1高表达(P<0.001)；
(2)肝癌组织中RFX1的低表达与肿瘤直径>5cm(P=0.011)、伴血管侵犯(P=0.026)和早期复发(P=0.015)相关，RFX1的表达状态与肝癌患者的年龄、AFP水平、HBsAg、GGT水平、Child分级、肿瘤包膜、肿瘤分化、肝硬化和BCLC分期等临床病理因素无明显关系(P＞0.05)；
(3)单因素分析显示AFP水平(OS，P＜0.001；TTR，P＜0.001)、肿瘤大小(OS，P＜0.001；TTR，P＜0.001)、肿瘤数目(OS，P=0.001；TTR，P＜0.001)，肿瘤细胞分化程度(OS，P=0.003；TTR，P=0.006)、肿瘤包膜(OS，P＜0.001；TTR，P＜0.001)、血管侵犯(OS，P＜0.001；TTR，P＜0.001)、BCLC分期(OS，P＜0.001；TTR，P＜0.001)和RFX1表达水平(OS，P=0.011；TTR，P=0.002)均与患者的预后相关；
(4)多因素分析显示RFX1的表达水平(OS，P=0.026；TTR，P=0.019)及肿瘤数目(OS，P=0.009；TTR，P＜0.001)、肿瘤细胞分化程度(OS，P=0.008；TTR，P=0.030)是影响肝癌预后的独立因素；
(5)在97例小肝癌患者中，肝癌组织中RFX1的表达水平与患者预后显著相关(OS，P=0.0004；TTR，P=0.0002)；在另外检测的71例小肝癌患者中，RFX1表达水平也与患者预后显著相关(OS，P=0.0002；TTR，P＜0.0001)。
结论：
(1)RFX1在肝癌组织中的表达下调，肝癌组织中RFX1的低表达与肝癌的肿瘤大小、血管侵犯及患者的早期复发相关;
(2)肝癌组织中RFX1的低表达是肝癌患者术后复发和不良预后的预测指标;
(3)肝癌组织中RFX1的表达可以作为一个预测小肝癌术后复发和生存的敏感指标。
第二部分RFX1在肝癌细胞侵袭中的调控作用及与上皮-间质转化的关系
研究背景
肝癌的侵袭转移是一个复杂的、多步骤、多基因参与的病理过程，其中，上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal transition, EMT)在肝癌的侵袭、转移过程中发挥了重要作用。E-cadherin的表达缺失是EMT的标志性变化之一，而Vimentin作为间质细胞的标志分子表达升高。
之前的研究表明RFX1在多个恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥了抑癌基因的功能。在恶性胶质瘤中，RFXl通过下调CD44的表达，抑制肿瘤细胞的侵袭性，从而发挥抑癌基因的功能。Su等的研究发现，RFX1通过激活酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制肝癌细胞的增殖，表明RFX1在肝癌中也发挥了抑癌基因的功能。但是，RFX1是否可以调控肝癌细胞的侵袭以及可能分子机制仍不清楚。
第二部分：
目的：
通过上调和下调肝癌细胞中RFX1的表达，检测肝癌细胞增殖能力、侵袭能力的变化以及EMT相关分子标志物的表达变化，分析RFX1在肝癌细胞侵袭过程中的作用及其与上皮-间质转化的关系，探讨RFX1表达在肝癌发生发展过程中的作用及意义。
方法：
(1)采用Westernblot法检测2株肝癌细胞系SMMC7721、Huh7中RFX1蛋白水平的表达情况;
(2)提取RFX1过表达质粒，将其转染至肝癌细胞系SMMC7721，采用Westernblot方法检测转染效率，并通过MTT细胞增殖实验、Transwell细胞侵袭实验，研究过表达RFX1调控肝癌细胞增殖、侵袭的作用;
(3)将RFX1的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)瞬时转染至肝癌细胞系Huh7，通过Westernblot评估其干扰效率，采用MTT细胞增殖实验、Transwell细胞侵袭实验，研究干扰RFX1表达调控肝癌细胞增殖、侵袭的作用;
(4)采用Westernblot法检测过表达和干扰RFX1表达后肝癌细胞EMT相关分子标志物E-cadherin、Vimentin的表达变化;
(5)采用免疫组化法检测118例肝癌组织中RFX1以及E-cadherin、Vimentin的表达情况，并分析其关联性；
(6)采用Westernblot法检测过表达RFX1后，Wnt/β-catenin信号转导通路关键蛋白β-catenin的表达变化。
结果：
(1)Westernblot显示，RFX1蛋白在肝癌细胞系Huh7和SMMC7721中表达存在明显差异，RFX1在细胞系Huh7中高表达，但在细胞系SMMC7721中几乎不表达;
(2)MTT实验及Transwell实验显示，过表达RFX1后肝癌细胞的增殖能力及侵袭能力显著下降；反之，下调RFX1表达水平肝癌细胞的增殖能力和侵袭能力显著上升;
(3)过表达RFX1后，EMT相关分子标志物E-cadherin表达增加，vimentin的表达下降(P＜0.05)。转染RFX1siRNA后，肝癌细胞E-cadherin表达下降，vimentin的表达增加;
(4)118例肝癌组织中，随着RFX1表达增加，E-cadherin表达增加，vimentin的表达下降，肝癌组织中RFX1的表达水平和E-cadherin呈正相关，和vimentin呈负相关；
(5)过表达RFX1后，Wnt/β-catenin信号转导通路关键蛋白β-catenin的表达下降。
结论：
(1)RFX1在侵袭能力弱的肝癌细胞Huh7中高表达，而在侵袭能力强的肝癌细胞SMMC7721中几乎不表达;
(2)RFX1过表达能够减弱肝癌细胞的增殖能力和侵袭能力，而干扰RFX1表达能够增强肝癌细胞增殖能力和侵袭能力;
(3)上调或下调RFX1表达，能够调控肝癌细胞EMT相关基因的表达；
(4)肝癌组织中RFX1的表达和E-cadherin表达正相关，和vimentin的表达负相关，RFX1参与了肝癌EMT的发生过程；
(5)RFX1可能通过Wnt/β-catenin信号转导通路调控肝癌EMT发生。
肿瘤的增殖、侵袭性生长以及转移是恶性肿瘤治疗困难的根本原因。目前常规的治疗手段难以从根本上完全清除恶性肿瘤细胞，因此，从分子水平揭示恶性肿瘤增殖、侵袭、转移的关键机制，建立起一套行之有效的治疗策略尤为重要，也是根治肿瘤的希望所在。近年来，一系列分子靶向药物应用于恶性肿瘤的治疗，受到了广泛关注。
调节因子X(Regulatory factors that bind to the X box，RFX)是一大类在进化上保守、而结构上含有76个高度保守的氨基酸序列的DNA结合域(DBD)、呈现翼状螺旋结构的蛋白质，可以结合在目的基因启动子或基因间区、内含子、外显子等基序上的保守的13-15个DNA碱基对的顺式调控元件X-box。在哺乳动物中陆续发现有7种RFX(RFX1～7)存在。RFXl是最早发现的家族成员，与神经系统的发育和功能形成密切相关，通过与靶基因上游的RFXl结合序列结合调控靶基因的表达，具有双重调控功能。RFX1与c-myc、PCNA及MAP1A基因上游结合位点为负性调控元件，RFX1抑制上述基因表达。相反，RFX1可以作为乙肝病毒增强子Ⅰ的转录因子激活乙肝病毒的复制与表达。
RFX1与肿瘤的发生、发展有着密切的关系，研究表明RFX1在人类恶性胶质瘤中的表达下调，上调恶性胶质瘤中RFX1的表达可以抑制肿瘤细胞的增殖，提示RFX1参与了胶质瘤的发生、发展；最新研究表明过表达RFXl可以下调CD44的表达，从而抑制胶质瘤的侵袭性；Feng等的研究也证实在神经母细胞瘤中过表达RFXl可以下调转化生长因子β2(transforminggrowthfactor-β2，TGFβ2)的表达，抑制肿瘤细胞的增殖。而Watts等通过研究发现RFX1在Barret食管癌变的过程中表达逐渐下降，提示RFX1可能参与了食管癌的发生、发展。最新的研究发现，RFX1可以通过激活酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制肝癌细胞的增殖，在肝癌中发挥了抑癌基因的功能。那么RFX1在肝癌组织中的表达有无异常，是否可以可以作为预测肝癌患者预后的分子指标，是否影响肝癌的侵袭转移及分子机制？这些问题的解决将有助于加深对肝癌生物学特征的理解和寻找更加有效的新型抑癌策略。
第一部分：RFX1在肝癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的关系
研究背景：
肝癌作为我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率居第4位，死亡率居第3位。近年来，随着更多的小肝癌患者被发现以及消融治疗、介入治疗及分子靶向治疗等治疗手段的进展，肝癌治疗效果有了很大的提高。但是，肝癌切除术后复发、转移率高，即使是小肝癌，根治性切除术后，仍有60%的患者发生复发、转移，使得肝癌患者的总生存仍然不容乐观。
目前临床上仍采用临床病理因素，如肿瘤大小、数目、血管侵犯来预测肝癌患者的预后。但是，这些预测指标难以预测小肝癌的预后。因此，寻找可以预测肝癌尤其是小肝癌患者预后的分子指标，有助于更好地发现高危复发风险的肝癌患者，从而采取个体化的治疗方案，提高患者的长期生存率。
研究显示，在多种恶性肿瘤中RFX1的表达下调，然而，目前尚无RFX1在肝癌组织中的表达及其对预后的预测价值的研究。
目的：
通过检测RFX1蛋白在肝癌组织及配对癌旁肝组织中的表达情况，分析RFX1表达与肝癌患者临床病理学特征及预后的关系，探讨RFX1在肝癌预后预测中的临床意义。
方法：
采用免疫组织化学(Immunohistochemical，IHC)方法检测221例肝癌(其中小肝癌97例)石蜡包埋癌组织及配对癌旁肝组织，另外检测71例小肝癌组织中RFX1蛋白的表达，分析肝癌组织中RFX1表达与肝癌患者临床病理特征及总生存期(Overall survival，OS)及复发时间(Time to recurrence, TTR)的关系。
结果：
(1)46.1%(102/211)的肝癌组织中RFX1高表达，显著低于癌旁肝组织中92.4%(195/211)的RFX1高表达(P<0.001)；
(2)肝癌组织中RFX1的低表达与肿瘤直径>5cm(P=0.011)、伴血管侵犯(P=0.026)和早期复发(P=0.015)相关，RFX1的表达状态与肝癌患者的年龄、AFP水平、HBsAg、GGT水平、Child分级、肿瘤包膜、肿瘤分化、肝硬化和BCLC分期等临床病理因素无明显关系(P＞0.05)；
(3)单因素分析显示AFP水平(OS，P＜0.001；TTR，P＜0.001)、肿瘤大小(OS，P＜0.001；TTR，P＜0.001)、肿瘤数目(OS，P=0.001；TTR，P＜0.001)，肿瘤细胞分化程度(OS，P=0.003；TTR，P=0.006)、肿瘤包膜(OS，P＜0.001；TTR，P＜0.001)、血管侵犯(OS，P＜0.001；TTR，P＜0.001)、BCLC分期(OS，P＜0.001；TTR，P＜0.001)和RFX1表达水平(OS，P=0.011；TTR，P=0.002)均与患者的预后相关；
(4)多因素分析显示RFX1的表达水平(OS，P=0.026；TTR，P=0.019)及肿瘤数目(OS，P=0.009；TTR，P＜0.001)、肿瘤细胞分化程度(OS，P=0.008；TTR，P=0.030)是影响肝癌预后的独立因素；
(5)在97例小肝癌患者中，肝癌组织中RFX1的表达水平与患者预后显著相关(OS，P=0.0004；TTR，P=0.0002)；在另外检测的71例小肝癌患者中，RFX1表达水平也与患者预后显著相关(OS，P=0.0002；TTR，P＜0.0001)。
结论：
(1)RFX1在肝癌组织中的表达下调，肝癌组织中RFX1的低表达与肝癌的肿瘤大小、血管侵犯及患者的早期复发相关;
(2)肝癌组织中RFX1的低表达是肝癌患者术后复发和不良预后的预测指标;
(3)肝癌组织中RFX1的表达可以作为一个预测小肝癌术后复发和生存的敏感指标。
第二部分RFX1在肝癌细胞侵袭中的调控作用及与上皮-间质转化的关系
研究背景
肝癌的侵袭转移是一个复杂的、多步骤、多基因参与的病理过程，其中，上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal transition, EMT)在肝癌的侵袭、转移过程中发挥了重要作用。E-cadherin的表达缺失是EMT的标志性变化之一，而Vimentin作为间质细胞的标志分子表达升高。
之前的研究表明RFX1在多个恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥了抑癌基因的功能。在恶性胶质瘤中，RFXl通过下调CD44的表达，抑制肿瘤细胞的侵袭性，从而发挥抑癌基因的功能。Su等的研究发现，RFX1通过激活酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制肝癌细胞的增殖，表明RFX1在肝癌中也发挥了抑癌基因的功能。但是，RFX1是否可以调控肝癌细胞的侵袭以及可能分子机制仍不清楚。
第二部分：
目的：
通过上调和下调肝癌细胞中RFX1的表达，检测肝癌细胞增殖能力、侵袭能力的变化以及EMT相关分子标志物的表达变化，分析RFX1在肝癌细胞侵袭过程中的作用及其与上皮-间质转化的关系，探讨RFX1表达在肝癌发生发展过程中的作用及意义。
方法：
(1)采用Westernblot法检测2株肝癌细胞系SMMC7721、Huh7中RFX1蛋白水平的表达情况;
(2)提取RFX1过表达质粒，将其转染至肝癌细胞系SMMC7721，采用Westernblot方法检测转染效率，并通过MTT细胞增殖实验、Transwell细胞侵袭实验，研究过表达RFX1调控肝癌细胞增殖、侵袭的作用;
(3)将RFX1的小干扰RNA(small interference RNA，siRNA)瞬时转染至肝癌细胞系Huh7，通过Westernblot评估其干扰效率，采用MTT细胞增殖实验、Transwell细胞侵袭实验，研究干扰RFX1表达调控肝癌细胞增殖、侵袭的作用;
(4)采用Westernblot法检测过表达和干扰RFX1表达后肝癌细胞EMT相关分子标志物E-cadherin、Vimentin的表达变化;
(5)采用免疫组化法检测118例肝癌组织中RFX1以及E-cadherin、Vimentin的表达情况，并分析其关联性；
(6)采用Westernblot法检测过表达RFX1后，Wnt/β-catenin信号转导通路关键蛋白β-catenin的表达变化。
结果：
(1)Westernblot显示，RFX1蛋白在肝癌细胞系Huh7和SMMC7721中表达存在明显差异，RFX1在细胞系Huh7中高表达，但在细胞系SMMC7721中几乎不表达;
(2)MTT实验及Transwell实验显示，过表达RFX1后肝癌细胞的增殖能力及侵袭能力显著下降；反之，下调RFX1表达水平肝癌细胞的增殖能力和侵袭能力显著上升;
(3)过表达RFX1后，EMT相关分子标志物E-cadherin表达增加，vimentin的表达下降(P＜0.05)。转染RFX1siRNA后，肝癌细胞E-cadherin表达下降，vimentin的表达增加;
(4)118例肝癌组织中，随着RFX1表达增加，E-cadherin表达增加，vimentin的表达下降，肝癌组织中RFX1的表达水平和E-cadherin呈正相关，和vimentin呈负相关；
(5)过表达RFX1后，Wnt/β-catenin信号转导通路关键蛋白β-catenin的表达下降。
结论：
(1)RFX1在侵袭能力弱的肝癌细胞Huh7中高表达，而在侵袭能力强的肝癌细胞SMMC7721中几乎不表达;
(2)RFX1过表达能够减弱肝癌细胞的增殖能力和侵袭能力，而干扰RFX1表达能够增强肝癌细胞增殖能力和侵袭能力;
(3)上调或下调RFX1表达，能够调控肝癌细胞EMT相关基因的表达；
(4)肝癌组织中RFX1的表达和E-cadherin表达正相关，和vimentin的表达负相关，RFX1参与了肝癌EMT的发生过程；
(5)RFX1可能通过Wnt/β-catenin信号转导通路调控肝癌EMT发生。