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禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus, aMPV)于1978年首次在南非报道,主要引起火鸡和鸡的上呼吸道或中枢神经系统疾病,如火鸡鼻气管炎(Turkey rhinotracheitis, TRT)和肉鸡的肿头综合征(Swollen head syndrome, SES)。目前为止,除了大洋洲之外其它地区都有aMPV的报道,禽偏肺病毒可以分为4个亚型(A、B、C、D),其中A亚型和B亚型在世界各地均有报道,C亚型和D亚型分别在美国和法国报道。我国于1999年首次分离并报道了该病毒,从而证实我国也有aMPV的流行,血清学调查显示山东省部分地区肉种鸡感染率可达100%,Owoade A. A.等2008年采用RT-PCR的方法对我国南方部分省市的鸡群进行了检测,结果A亚型阳性检出率达到39%,B亚型为阴性。为了进一步了解我国aMPV的流行情况,本研究重点从病原学和血清学方面进行研究,从而为本病的预防控制提供理论依据。本研究内容分为三部分:一.禽偏肺病毒RT-PCR检测方法的建立及应用根据GenBank中已经发表的B亚型禽偏肺病毒F基因的保守序列,设计并合成一对引物,建立了禽偏肺病毒的RT-PCR检测方法,目的片段大小为725bp。该方法能从禽偏肺病毒阳性病料中扩增到725bp的特异性片段,而新城疫病毒、传染性支气管炎病毒和H9N2禽流感病毒扩增结果均为阴性,敏感性试验显示该方法的最低检出量为1.45 pg/μL,表明所建立的RT-PCR方法特异性强、敏感性高。应用该方法对山东省不同地区具有呼吸道症状的商品肉鸡肺组织样品492份进行检测,阳性检出率为43.09%。随机选择不同地区的11份阳性结果,进行克隆测序,并对序列进行分析,结果显示所扩增到的阳性产物均为B亚型的禽偏肺病毒。二、禽偏肺病毒核酸探针检测方法的建立及应用回收并纯化RT-PCR扩增出的725bp的基因片段,用地高辛标记,制备出地高辛标记的B亚型aMPV核酸探针。特异性检测结果表明,该探针能与aMPV核酸发生特异性杂交,而与H9N2亚型AIV、NDV、IBV、E.coil和SPF鸡胚组织的核酸杂交反应均为阴性;敏感性检测结果表明,该探针对aMPV的最低检出量为5pg。应用制备的探针对山东省不同地区的605份商品肉鸡和122份商品肉鸭进行了核酸探针检测,阳性检出率分别为36.59%(180/492)和30.33%(37/122)。本研究制备的aMPV地高辛探针特异性强、敏感性好,对样品的检测结果表明,山东省部分地区的商品肉鸡和商品肉鸭中普遍存在带毒现象。三、禽偏肺病毒间接ELISA检测方法的建立及应用将纯化的B亚型禽偏肺病毒重组G蛋白作为包被抗原,包被96孔ELISA板后,摸索反应条件:抗原的最佳包被量为800ng/孔;血清的稀释倍数为1:50;重组蛋白的最佳包被条件为4℃过夜、最佳包被液为碳酸盐缓冲液(pH9.6);最佳封闭液为5%脱脂奶粉,最佳封闭时间为37℃封闭1h;血清最佳反应时间为90min;酶标二抗的最佳稀释倍数为1:1000、最佳作用时间为60min;底物最佳反应时间为10min;阳性的Cut-off值为0.292(Cp=X+3SD)、阴性的Cut-off值为0.258(Cn=X+2SD);用该间接ELISA与美国IDEXX公司的aMPV抗体检测试剂盒对临床样品进行平行检测,结果二者的总符合率为96.0%。表明建立的ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。应用该方法对山东省7个地区的1139份鸡血清进行检测,阳性检出率为37.05%(422/1139),其中商品蛋鸡阳性率最低为11.41%(42/368),肉种鸡最高为62.95%(226/359),商品肉鸡为37.38%(154/412)。结果表明,aMPV感染在山东省部分地区的鸡群中是普遍存在。