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第一章：HMGB1在胆脂瘤性中耳炎的骨质破坏机制中的作用研究背景：中耳乳突胆脂瘤是常见病,也是难治性和慢性进行性、破坏性疾病,其主要特征表现为中耳腔内大量增殖的角化鳞状上皮和邻近骨质破坏以及角化细胞凋亡,其中骨质破坏作用是胆脂瘤的主要特征之一。由于胆脂瘤的骨质破坏作用可以导致众多颅内外并发症的发生,故现在的研究重点基本上集中在对胆脂瘤骨质破坏机制的研究上。然而,对胆脂瘤引起骨质破坏的确切原因尚不清楚,细胞因子参与的骨质吸收作用成为研究的热点上。其中TNF-α和IL-1β被认为是与胆脂瘤的骨质破坏作用相关的重要的细胞因子,但对上述两个细胞因子的来源尚不清楚。HMGB1是近年研究发现的一种重要的炎性介质,是促炎细胞因子反应网络的中心环节,是新近发现的一种危险信号分子。细胞核内的HMGB1的主要功能是DNA结合功能,无需特异的识别序列,能广泛结合单链或双链DNA,甚至能与受损的DNA结构结合。由于HMGB1和DNA非特异结合的亲和力低,能通过核孔在细胞核与胞浆间进行穿梭,与其他的核蛋白不同之处在于HMGB1可释放到胞外,作为细胞因子,发挥着促炎、调节神经细胞轴突生长、肿瘤转移以及动脉粥样硬化和血管损伤后再狭窄等多种病理生理效应。近年研究发现,胞外的HMGB1作为一种重要的炎症介质和致炎细胞因子,与关节炎、急性肺炎、脓毒症、肝炎、自身免疫性疾病等的发病机理关系密切。尽管目前对HMGB-1在上述多种疾病的炎症的发生发展中的作用有了较多的认识和肯定,但在胆脂瘤性中耳炎中HMGB1的表达及释放及其在该病中所起的作用未有任何研究。研究目的：HMGB1在正常外耳道上皮和胆脂瘤性中耳炎中的表达与定位及HMGB1刺激胆脂瘤上皮细胞后能否释放炎症细胞因子。研究方法：1、采用免疫荧光的方法研究HMGB1在中耳胆脂瘤组织中的表达及定位。2、通过紫外线照射胆脂瘤上皮细胞建立胆脂瘤细胞凋亡模型。3、用凋亡上清液刺激胆脂瘤上皮细胞,观察凋亡上清液刺激后HMGB1表达和释放的规律。4、用凋亡上清液刺激胆脂瘤上皮细胞后,检测培养上清液中IL-1β. TNF-α的表达及释放的变化,观察这些因子的变化与HMGB1表达和释放的关系。用凋亡上清液刺激胆脂瘤上皮细胞后,检测培养上清液中IL-1β. TNF-α的表达及释放的变化,观察这些因子的变化与HMGB1表达和释放的关系。结果：1、在胆脂瘤组织中HMGB-1表达出现亚细胞分布部位的改变,即角质形成细胞的胞浆和胞外出现了强阳性的表达,角质形成细胞的核内表达减少(在原发性胆脂瘤组织中更明显),而且表达总量较正常的外耳道上皮上调。2、用紫外线照射诱导胆脂瘤上皮细胞凋亡,在培养箱中培养16-24小时后,发现凋亡上清液中有HMGB1的表达。3、用凋亡上清液刺激胆脂瘤上皮细胞,发现刺激后4h开始,细胞培养液中的HMGB1的含量明显增加,并一直持续到48h。5、刺激前HMGB1蛋白主要分布在细胞核内,胞浆中的含量几乎没有,用凋亡上清液刺激后1h后细胞浆内的HMGB1蛋白含量逐渐增加达到高峰,随后逐渐减少,至24小时胞浆内的HMGB1的含量达到低谷(仍高于刺激前),随后又逐渐升高,至刺激后48小时细胞浆内的HMGB1蛋白的含量维持在较高的水平。6、用凋亡上清液刺激胆脂瘤上皮后,培养液中的TNF-α的含量在刺激后1h开始增高,4小时达到高峰,在刺激后48小时,培养液中的TNF-α的含量维持在较高的水平；细胞培养液中的IL-1β的含量在凋亡上清液刺激后1h开始增高,48h达到高峰(除12小时点外)。结论：1.在胆脂瘤组织中HMGB-1表达出现亚细胞分布部位的改变,即角质形成细胞的胞浆和胞外出现了强阳性的表达。2.胆脂瘤组织中胞外HMGB1的来源有两个：一是胆脂瘤上皮细胞在凋亡讨程中释放；二是胆脂瘤上皮细胞凋亡过程中释放的凋亡产物诱导胆脂瘤上皮细胞主动释放。3.胞外的HMGB-1蛋白可以诱导胆脂瘤上皮细胞合成和释放TNF-α和IL-1β,从而参与局部炎症反应及胆脂瘤对周围骨质的吸收破坏。第二章：LL-37在胆脂瘤性中耳炎的炎症反应机制中的作用研究背景：中耳胆脂瘤是一种常见病,其主要的特征表现为中耳腔存在大量的、增殖的、角化的鳞状上皮和邻近骨质的破坏,以及程序性角化细胞凋亡。中耳胆脂瘤的重要特征之一是上皮的过度增殖和凋亡增强。研究表明细胞凋亡增多,对凋亡细胞产物的清除减少,凋亡的细胞会释放大量的DNA片段到胞外环境中。胞外的DNA通过刺激或抑制免疫细胞的活性从而起到免疫调节的功能。DNA的这些免疫调节作用暗示固有免疫反应的免疫原不仅仅是病原体的DNA(细菌的,病毒的),也可以是异常的或不应该存在的DNA片段。LL37是迄今为止在人体内发现的惟一的cathelicidins家族抗菌肽,LL-37在固有免疫系统中的重要作用是它可以与自身DNA结合形成一种免疫复合物,打破了针对自身DNA的天然耐受,激活pDC内的TLR9并诱导IFN的产生。尽管目前对LL-37在银屑病、自身免疫性疾病等疾病中作用有了较多的认识和肯定,但在胆脂瘤性中耳炎中LL-37的表达及其在该病中所起的作用未有任何研究。研究目的：DNA片段在原发性胆脂瘤和继发性胆脂瘤中的表达以及DNA片段在胆脂瘤性中耳炎的炎症反应机制中的作用。研究方法：1、采用Tunel方法研究在胆脂瘤上皮细胞在凋亡过程中有无DNA释放到胞浆及胞外。2、通过免疫荧光及western blot方法检测胆脂瘤组织中LL-37及MxA的表达情况。3、采用CPG-DNA、LL-37、CPG-DNA+LL-37刺激胆脂瘤上皮细胞,观察刺激后TLR-9及IFN-α表达和释放的规律。结果：1、在胆脂瘤组织的角质形成细胞的胞浆和胞外出现了DNA片段的强阳性表达。2、LL-37在正常的外耳道上皮组织中呈弱阳性表达；在伴鼓膜完整的原发性胆脂瘤中无表达；在伴鼓膜穿孔的原发性胆脂瘤及继发性胆脂瘤中LL-37呈强阳性表达,这两者的表达总量相当,较伴鼓膜完整的原发性胆脂瘤和正常的外耳道上皮上调。3、MxA在正常的外耳道上皮组织中无表达；在伴鼓膜完整的原发性胆脂瘤中呈无表达表达；在伴鼓膜穿孔的原发性胆脂瘤组织中呈阳性表达,在继发性胆脂瘤中MxA呈强阳性表达,表达总量较伴或不伴鼓膜穿孔的胆脂瘤和正常的外耳道上皮上调。4、正常培养的胆脂瘤上皮细胞和凋亡的胆脂瘤上皮细胞的胞浆内有DNA片段的存在。5、CPG-DNA+LL-37联合刺激组中可检测到IFN-α基因的表达上调,而CPG-DNA和LL-37单独刺激组中未见IFN-α基因的表达上调。结论：1.胆脂瘤组织中存在DNA片段,这为角质形成细胞或免疫细胞识别这些未被降解的DNA片段提供了基础。2.胆脂瘤上皮细胞的胞浆内本身就存在DNA片段以及胆脂瘤上皮细胞在凋亡过程中可以释放DNA片段,这成为胆脂瘤组织中DNA片段的来源。3.MxA在继发性胆脂瘤中的表达程度高,这与LL-37的表达量呈正相关。4.胆脂瘤上皮细胞能识别CPG-DNA从而诱导IFN-α的表达,而且这种识别和诱导需要LL-37的参与和辅助。5.自身DNA片段可以引起胆脂瘤性中耳炎的炎症反应,其中需要LL-37的辅助。