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从昆明理工大学生物工程技术研究中心冷库分离筛选到1株低温脂肪酶产生菌株,根据形态学和16S rRNA基因序列分析,将其初步鉴定为假单胞菌属,并命名为Pseudomonas sp. PF16,简称PF16。PF16所产脂肪酶为胞内酶,该酶能水解橄榄油,在0℃仍显示有酶活,证明该酶为低温脂肪酶。PF16菌株在25℃发酵24 h后,经离心、收集菌体、超声波破碎、超滤、盐析等过程,获得粗酶液Lip-PF16。对其进行了温度稳定及pH稳定性研究。实验结果表明,Lip-PF16在0-25℃、pH 7.5-10范围内稳定,属于碱性低温脂肪酶。该酶具有良好的低温催化活性,在食品、洗涤、低温环境修复等工业上有着巨大的应用潜力。但该原始菌株产酶量低,培养周期长,不利于后续的研究与开发,必须克隆该脂肪酶基因进行高效表达。因此,本研究采用了两种克隆的策略：一是通过构建基因文库的方法来筛选脂肪酶基因；二是利用PCR克隆拼接的方法即运用BLASTp程(?)ClustalX序列分析软件进行序列比对分析,通过比对假单胞菌属的脂肪酶基因,找到它们的保守区域,然后根据保守序列设计简并引物分段扩增潜在的脂肪酶基因,最后通过拼接获得脂肪酶的全基因序列。实验表明,通过构建基因文库的方法较难筛选到脂肪酶基因,而利用PCR克隆拼接法能有效扩增出了脂肪酶全基因。该基因由1431bp碱基组成,编码476个氨基酸,预计分子量为50,230,理论等电点为4.58。氨基酸序列分析表明,lip-PF16属于家族I.3成员,与低温脂肪酶(ABI94371)有88%的相似性,与Pseudomonassp.MIS 38的低温脂肪酶有79%的相似性,进一步证明了该酶为低温脂肪酶。在此基础上,利用基因重组技术构建了表达载体lip-PF16/pET21a,将lip-PF16基因在大肠杆菌中进行了表达。实验结果表明,lip-PF16基因在大肠杆菌中得到了高效表达。通过SDS-PAGE检测,发现表达的蛋白质大多是以包涵体的形式存在,可溶性的不多。但少量的可溶性脂肪酶,既使在低温下也显示出了较高酶活。本研究以产碱性低温脂肪酶菌株Pseudomonas sp. PF16为实验材料,运用分子生物学技术获得了一个碱性脂肪酶基因,并在大肠杆菌中得到了高效表达,本研究为进一步对该碱性脂肪酶的研究与开发奠定了基础。