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类黄酮是植物体内的一类非常重要的次生代谢产物,主要分为黄酮、黄酮醇、黄烷酮、异黄酮、花青苷、原花青素几类。蔷薇科梨属(Pyrus spp.)植物,是一类在全球温带地区广泛栽培的果树。通常来说,MBW复合体通过调控类黄酮生物合成途径中的结构基因参与到类黄酮的转录调控过程。在类黄酮生物合成途径中,编码类黄酮生物合成酶的结构基因已经被鉴定出来,并且其功能也得到了验证,但梨果实中类黄酮的转录调控机制还没有被阐释清楚。本研究以种间杂种‘红早酥’梨和西洋梨品种‘茄梨’愈伤组织为试材,研究了不同类型的R2R3-MYB转录因子调控红梨类黄酮合成的分子机制,并进一步解析了茉莉酸调控红梨着色的分子机制。主要研究内容如下:1)Pp MYB17正调控梨类黄酮生物合成。在植物中,MYB转录因子被认为是类黄酮生物合成的关键调控因子,对新型MYB转录因子的鉴定有助于梨中类黄酮调控网络的拓展。基于我们之前的转录组数据,我们鉴定到了一个与梨果实类黄酮含量呈正相关的R2R3型转录因子Pp MYB17。在本研究中,我们从‘红早酥’梨中克隆得到Pp MYB17并对其功能进行研究。结果发现,光照能诱导‘红早酥’梨果实中Pp MYB17的上调表达。另外,系统进化树分析表明Pp MYB17可能参与调控梨果实的黄酮合成。亚细胞定位实验表明Pp MYB17位于细胞核。在‘茄梨’愈伤组织和拟南芥中分别过表达Pp MYB17表明Pp MYB17通过诱导黄酮生物合成结构基因(尤其是Pp FLS)的表达来促进梨愈伤和拟南芥中的类黄酮含量。LC-MS/MS检测结果显示,与野生型愈伤相比,过表达Pp MYB17显著提高了愈伤中黄酮、黄酮醇、黄烷酮、异黄酮、花青素的含量。进一步通过酵母杂交实验发现,Pp MYB17不能与Ppb HLH3、Ppb HLH33和Pp WD40互作。双荧光素酶实验结果表明Pp MYB17能显著激活类黄酮生物合成途径中关键下游基因Pp CHS、Pp CHI、Pp F3H、Pp FLS和Pp UFGT的启动子,且该激活作用不依赖于Ppb HLH3。上述结果表明Pp MYB17可能通过调控上述基因的表达来增强梨果实中类黄酮的生物合成。这些实验有助于进一步阐明类黄酮生物合成调控网络,从而有可能培育出具有较高类黄酮含量的梨新品种。2)Pp MYB140抑制梨花青苷生物合成。除了激活型MYB外,抑制型MYB也会参与类黄酮的生物合成调控。梨上关于MYB抑制子负调控类黄酮生物合成的研究仍较少。通过挖掘转录组,我们发现Pp MYB140是一个潜在的抑制类黄酮生物合成的R2R3型MYB转录因子。我们从‘红早酥’梨中克隆出Pp MYB140并对其进行功能研究。R2R3-MYB蛋白包含多个亚组,系统进化树分析表明Pp MYB140属于具有转录抑制功能的第4亚组,其C末端包含一个保守的C1抑制子基序和一个预测的C2抑制子基序。和黑暗对照相比,光照处理后的‘红早酥’梨果实中Pp MYB140的表达量显著下调。我们利用酵母系统进一步验证了Pp MYB140的抑制效应,且亚细胞定位实验表明Pp MYB140定位在细胞核内。以上的结果表明Pp MYB140是转录抑制因子。梨愈伤中过表达Pp MYB140可以显著下调类黄酮生物合成基因(Pp CHS、Pp CHS、Pp F3H、Pp DFR、Pp UFGT和Pp ANS)与MBW复合体成员基因(Pp MYB10、Ppb HLH3和Pp WD40)的表达,进而抑制Me JA诱导的花青苷合成。以上结果表明Pp MYB140负调控梨花青苷的生物合成。进一步研究表明Pp MYB140在核内与b HLH3、b HLH33互作,从而形成MYB140-b HLH-WDR[M(140)BW]复合体,Pp MYB140与Ppb HLHs结合会抑制花青苷结构基因的启动子活性。除此之外,Pp MYB140干扰Pp MYB114与b HLHs的结合,阻碍[M(114)BW]复合体的形成,进而抑制梨上花青苷的生物合成。这些实验有助于我们更好的理解梨花青苷合成的负调控网络机制。3)梨愈伤组织中类黄酮的生物合成主要由MYB家族成员调控。类黄酮的生物合成受多种因素的影响,其中植物激素对类黄酮生物合成的影响很大。茉莉酸甲酯(Me JA)可以增强梨果实中类黄酮的积累,然而Me JA诱导类黄酮生物合成的潜在机制还不清楚。为了阐述该分子机制,我们利用Me JA处理处理梨愈伤组织,结果表明Me JA处理可以显著提高愈伤组织中类黄酮(尤其是花青苷)的含量。我们将Me JA处理的梨愈伤进行转录组测序,并进一步进行WGCNA分析,以此鉴定了与Me JA诱导的类黄酮生物合成相关联的差异表达基因。结果表明,Me JA处理诱导了类黄酮生物合成结构基因(Pc CHS、Pc CHI、Pc F3H、Pc DFR、Pc ANS、Pc ANR2a和Pc LAR1)的表达。Me JA诱导的类黄酮生物合成主要由MYB家族成员调控,b HLH、AP2-EREBP、NAC、WRKY与TIFY也参与其中。除了已知在梨花青苷生物合成中具有正调控作用的Pc MYB10外,我们还发现了其他几个可能调控黄酮和原花青素生物合成的MYB候选基因。酵母双杂及Bi FC实验表明Pc MYB10与Pc MYC2存在蛋白互作,并且可以与JAZ蛋白(Pc JAZ1和Pc JAZ2)结合。Pc MYB10–Pc MYC2复合体可能在转录水平上参与JA介导的类黄酮生物合成的调控。上述试验阐述了梨愈伤组织中Me JA诱导的类黄酮积累相关的转录调控机制,为后续研究打下坚实的基础。综上所述,本文研究了梨上两个调控类黄酮生物合成的MYB转录因子的生物学功能。Pp MYB17通过激活类黄酮生物合成特异下游基因的启动子进而正调控类黄酮的生物合成,在此过程中Pp MYB17独立于MBW复合体中的b HLH和WD40发挥功能。Pp MYB140通过干扰Pp MYB114与b HLHs的结合来阻止M(114)BW复合体的形成,从而抑制梨花青苷的生物合成。此外,分析Me JA处理的梨愈伤组织的转录组数据表明,在梨愈伤组织中Me JA诱导的类黄酮生物合成主要由MYB家族成员调控,b HLH、AP2-EREBP、NAC、WRKY与TIFY家族也参与其中。目前转录组分析已经鉴定出了一系列与Me JA介导的类黄酮转录调控相关的候选基因,有待进一步的功能研究。