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网格蛋白介导的膜蛋白运输(clathrin-mediated trafficking)在动植物细胞胞外物质吸收、质膜蛋白外吐、内吞与降解、胞内外信号传递等细胞生物学过程中具有重要生物学功能。在植物细胞中,网格蛋白主要定位于细胞质膜、反式高尔基网络或早期内体(trans-Golginetwork/earlyendosome;TGN/EE)上。因此,网格蛋白主要在质膜和TGN/EE上发挥其生物学功能。然而,网格蛋白在质膜和TGN/EE上的具体招募机制目前仍没有被彻底弄清楚。最近的研究表明,拟南芥网格蛋白被招募到质膜和TGN/EE上分别由接头蛋白AP2(adaptor protein 2)和AP1复合体来介导完成。AP1复合体是由AP1γ、AP1/2β、AP1μ和AP1σ组成的异源四聚体,定位于TGN/EE上;而AP2复合体是由AP2α、AP1/2 β、AP2μ和AP2σ组成异源四聚体,定位于细胞质膜上。目前对拟南芥AP2亚基的生物学功能鉴定及其网格蛋白质膜招募机制的研究相对较为深入,而对AP1复合体的功能研究相对比较落后。为此,本研究利用生物信息学、遗传学、细胞生物学和生理生化等分析技术,分析鉴定了 AP1σ亚基的遗传学功能和亚细胞定位,具体研究结果如下:(1)利用生物信息学分析技术和哺乳动物AP1σ氨基酸序列,发现了拟南芥基因组含有两个AP1σ同源基因,分别被命名为AP1σ1和AP1σ2。氨基酸同源序列比对发现,AP1σ1和AP1σ2的同源性高达97%,与哺乳动物的同源性为58%。(2)利用PCR和RT-PCR技术,成功分离并鉴定了两个AP1σ1和AP1σ2功能缺失突变体ap1σ1-1和ap1σ2-1,并进一步制备了ap1σ1-1 aplσ2-1双突变体。发育表型分析结果表明,ap1σ2-1的花器官与野生型相似,但豆荚短小、结实率显著下降,ap1σ1-1ap1σ2-1(杂合het/纯合hom)的结实率比ap1σ2-1单突变体更低,ap1σ1-1ap1σ2-1(hom/hom)的根短小、下胚轴较粗、子叶深色,且幼苗致死。相反,ap1σ1-1的植株生长发育和结实率等表型与野生型相似。(3)亚历山大染色镜检结果表明,ap1σ1-1的花粉活性、数量与野生型完全相似。尽管ap1σ2-1和ap1σ1-1ap1σ2-1(het/hom)花粉活性正常但数量比野生型显著减少,并且,ap1σ1-1 ap1σ2-1(het/hom)数量比ap1σ2-1更少。这些分析结果与突变体结实率分析结果相一致,表明AP1σ2功能缺失抑制花粉形成从而影响植株育性,但AP1σ1与AP1σ2在育性上有一定的功能冗余性。(4)利用分子克隆技术和转基因方法,制备了35S::AP1σ1-GF 和35S::AP1σ2-GFP转基因植株,用激光共聚焦显微镜观察证实融合蛋白成功表达,定位于胞内并且呈斑点状分布。荧光共定位分析结果显示,AP1σ1-GFP和AP1σ2-GFP与TGN/EE定位的分子标记AP1μ-RFP、CLC1-mKO有较高的共定位系数(0.6-0.8),即有高达60～80%荧光信号完全共定位,表明AP1σ的确定位于TGN/EE上。根据以上分析结果,本研究可初步获得以下结论:拟南芥基因组含有2个AP1σ亚基基因AP1σ1和AP1σ2,其中,AP1σ2功能缺失抑制了花粉的形成或发育,从而引起花粉数量下降,最终导致植株结实率下降;AP1σ1和AP1σ2功能同时缺失引起幼苗致死。此外,AP1σ定位于TGN/EE上,证实了 AP1复合体的确在TGN/EE起作用。这些分析结果为进一步研究AP1的生物学功能打下了坚实的基础,为阐明AP1介导的网格蛋白TGN/EE招募机制提供了新的研究材料。