【摘 要】
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本文旨在研究重组牛乳铁蛋白素(bovine lactofericin,LfcinB)及其突变衍生物在大肠杆菌中的高效表达及其抗菌活性对比,进而寻找到一种活性更强的抗菌肽。为达到此目的,本论文
【出 处】
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中国科学院研究生院 中国科学院大学
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本文旨在研究重组牛乳铁蛋白素(bovine lactofericin,LfcinB)及其突变衍生物在大肠杆菌中的高效表达及其抗菌活性对比,进而寻找到一种活性更强的抗菌肽。为达到此目的,本论文进行了以下几方面的工作:
1.在大肠杆菌中构建T7RNA聚合酶双启动子表达体系
将一号载体IR-oriR6K-loxP*-genta-loxP*-tetR-Ptet-T7RNApol-IR(四环素调控表达T7聚合酶启动子)和二号载体pPt7-Ptet-cipB-DP-LfcinB(携带目的基因)转入大肠杆菌GB2005中,使得GB2005中存在新的T7RNA聚合酶双启动子的蛋白表达系统,该质粒中包含四环素和T7两个启动子,使用四环素诱导两个启动子,不仅能够提高目的蛋白的表达量,而且够降低生产成本。
2.融合蛋白cipB-DP-LfcinB在大肠杆菌中的表达
在YZ2005中使用Red/ET同源重组技术,构建融合表达质粒pT7Rpro-Tet-cipB-DP-LfcinB,将其电击转入大肠杆菌GB2005中,经四环素诱导表达,获得的融合蛋白cipB-DP-LfcinB。融合蛋白用0.1N HCl溶液,85℃处理2个小时,分离cipB蛋白和LfcinB之间的两个氨基酸天冬氨酸、脯氨酸(-Asp-Pro-)DP,获得LfcinB。SDS-PAGE电泳检测表明LfcinB表达量占总蛋白量的20％。
3.重组LfcinB的生物学活性检测
通过对LfcinB原有序列中的一些氨基酸进行突变,获得了新的抗菌活性更强的LfcinB突变衍生物(GB-LfcinB)。体外抑菌试验表明GB-LfcinB对革兰氏阴性菌大肠杆菌致病菌有极好的抗菌性能。以21日龄断奶仔猪为动物模型检测GB-LfcinB的抗菌促生长功能,实验选用36头21日龄健康二元杂(长白×大约克)断奶去势仔猪(5.83±0.59 kg),按随机处理分为3组:对照组(CR),0.01％LfcinB组(LfcinB),0.01％LfcinB衍生物组(GB-LfcinB),进行为期21天的饲养试验,研究GB-LfcinB对断奶仔猪生长性能的影响。该试验表明,与对照组和LfcinB组相比,GB-LfcinB显著提高断奶仔猪平均日增重、平均日采食量以及料肉比(P<0.05),并且能够有效地防止仔猪腹泻。
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