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微小RNA（microRNA，miRNA)是一类长度约19-25个核苷酸的单链非编码小分子 RNA，主要通过与靶基因 mRNA分子的3‘非翻译区（3‘ untranlated region，3‘-UTR）特异结合，引起mRNA降解或翻译抑制，从而在转录水平或转录后水平调节基因的表达。近年来发现 miRNA与肿瘤的发生、发展和预后有密切的关系,在其中发挥―促癌‖或―抑癌‖的作用。如何发现与肿瘤相关的miRNA，阐明其功能及调控机制，并将它们整合到基因调控网络中是近年来医学研究的热点和前沿。 miR-181a基因位于染色体脆性位点中，由于脆性位点异常与肿瘤发生密切相关，提示miR-181a可能在肿瘤的发生中起作用。已有的研究表明，miR-181a的确与多种肿瘤相关，但是在不同肿瘤中发挥着不同的功能，例如在乳腺癌、卵巢癌等中表达上调发挥―癌基因‖作用，而在非小细胞肺癌、神经胶质瘤等中表达下调发挥―抑癌基因‖作用。然而在神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）中，目前有少量研究提示miR-181a可能起重要作用，但其功能及调控机制不清，本文第二章我们对 miR-181a在 NB中的表达、功能及靶基因进行了研究。在miRNA芯片研究中，我们发现 miR-181a与儿童急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）复发及预后相关，但功能及作用机制尚不明确。白血病细胞耐药是导致白血病复发最重要的原因。本文第三章我们检测miR-181a在复发ALL患儿及白血病耐药细胞系CEM/C1中的表达水平，并研究其在ALL细胞株CCRF-CEM及耐药株CEM/C1中的功能，以期阐明miR-181a在ALL细胞耐药中的作用，为儿童难治及复发ALL的治疗提供新的思路。 结果简述如下： （1）miR-181a在NB中高表达。采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测了25例NB患儿及3例良性肿瘤石蜡标本中 miR-181a的表达情况，发现miR-181a在NB中明显高表达。 （2）miR-181a促进NB细胞系SK-N-SH和SH-SY5Y细胞增殖及克隆形成。通过miR-181a过表达和抑制实验研究了miR-181a在NB细胞中的功能。结果表明过表达miR-181a能促进SK-N-SH和SH-SY5Y细胞增殖及克隆形成，下调miR-181a能抑制SK-N-SH和SH-SY5Y细胞增殖及克隆形成。以上结果表明miR-181a在NB的发生中起―癌基因‖作用，促进NB形成。 （3）初步验证了ARID2为miR-181a在NB中的靶基因。利用生物信息学的方法预测了ARID2为其靶基因，通过构建miR-181a表达载体和含ARID23‘-UTR片段的双荧光报告载体，将两者共转染293T细胞，通过双荧光报告检测miR-181a对所预测的靶基因的抑制作用。结果显示，miR-181a对ARID2基因的抑制率达41.1％。qRT-PCR的方法在SH-SY5Y细胞中验证了miR-181a与ARID2的负相关关系。结果显示，细胞中转染了anti-miR-181a后，ARID2 mRNA表达明显上调；转染了miR-181a mimics后，ARID2 mRNA表达明显下降。以上结果证实了ARID2是miR-181a的下游靶基因。因此，我们推测，miR-181a可能是通过靶向ARID2从而在NB中发挥作用。 （4）miR-181a在ALL复发组及耐药株CEM/C1中异常高表达。我们采用qRT-PCR检测了共18对儿童ALL初诊-完全缓解、初诊-复发患儿骨髓样本中miR-181a的表达。结果显示miR-181a在儿童ALL初诊组异常高表达，完全缓解组恢复正常水平，复发组异常高表达。采用 qRT-PCR检测 ALL细胞系CCRF-CEM及其耐药细胞系 CEM/C1中 miR-181a的表达情况。结果显示miR-181a在耐药细胞系CEM/C1中明显高表达。这一结果表明miR-181a可能与ALL的复发及耐药有关。 （5）抑制miR-181a能明显增加耐药细胞系CEM/C1的药物敏感性；上调miR-181a能明显提高敏感株 CCRF-CEM的细胞耐药性。通过电穿孔转染抑制耐药细胞系CEM/C1中miR-181a的表达或上调敏感株CCRF-CEM中miR-181a的表达，随后按浓度梯度予以喜树碱处理，并采用CCK-8（Cell Counting Kit-8）法检测各浓度梯度下细胞的存活情况，绘制细胞存活曲线并计算IC50（半数抑制浓度）。结果显示，同一药物浓度刺激下，CEM/C1细胞株 anti-miR-181a组较对照组anti-miR-NC组存活率明显降低，IC50分别为30.61 ng/ml、2255 ng/ml，耐药指数（RI）=73.67，可见抑制miR-181a能明显增加耐药细胞系CEM/C1的药物敏感性；同一药物浓度刺激下，CCRF-CEM细胞株miR-181a组较miR-NC组存活率明显升高，IC50分别为126.60 ng/ml、1.34 ng/ml，RI=94.26，可见在敏感株CCRF-CEM中上调miR-181a能明显提高细胞耐药性。 本论文的研究工作初步探讨了miR-181a在儿童NB及ALL复发中的表达及功能，发现在NB中miR-181a明显高表达，并能促进细胞增殖及克隆形成；并初步验证了ARID2为其靶基因。在ALL中，miR-181a与ALL复发及细胞耐药性有关，并发现过表达miR-181a能提高敏感株CCRF-CEM的耐药性，抑制miR-181a能增加耐药细胞系CEM/C1对喜树碱的敏感性，为难治及复发白血病的治疗提供了新的思路。综上所述，在NB及ALL中，miR-181a都发挥着―癌基因‖作用，此研究结果可能为肿瘤的治疗提供新靶点。