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目的:五灵脂为鼯鼠科动物复齿鼯鼠的干燥粪便,功效活血化瘀、通经止痛。五灵脂在临床上主要用于心血管疾病及妇科疾病,且疗效显著,但其存在的安全隐患、有效成分不明确、临床依从性不高等问题限制了该药材的开发和应用。本研究从安全性问题及有效成分不明确问题出发,首先旨在通过微生物限度检查法研究五灵脂中微生物总体数量及条件致病菌污染情况,以期对五灵脂中的微生物是否影响药材临床用药安全问题做出解释;其次通过高通量测序法分析五灵脂中天然微生物的结构组成,对其可培养细菌及真菌进行分离鉴定,并通过建立双向发酵体系对所得细菌及真菌的功能进行研究,为菌群是否是五灵脂有效成分之一提供部分依据。综合以上两方面内容,进而为挖掘五灵脂中天然益生菌,开发五灵脂新剂型,提高患者临床依从性奠定基础。方法:本文第一章经市场调查,收集21份五灵脂样品,根据2015年版《中国药典》第四部微生物限度检查项下相关方法对五灵脂中需氧菌总数、霉菌及酵母菌总数的计数方法,大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的检查方法进行适应性考察,并以合适的方法对21批五灵脂药材及其水煎液中微生物进行限度检查;本文第二章以道地产区陕西省商洛市某复齿鼯鼠仿野生养殖地无菌采集的10份样品为代表,采用高通量测序技术对其微生物的16S rDNAV3-V4区进行测序,经生物信息学分析对五灵脂药材中菌群种类及丰度进行初步表征,并通过COG和KEGG数据库预测菌群的潜在功能。同时通过平板划线对五灵脂中可培养微生物进行培养、分离及菌种保存,扩增细菌单菌株的16S序列、真菌的ITS1序列及β-tubulin序列,将所得序列经Blast在线比对,并使用软件MEGA 5.0分析同源序列,构建系统发育树,鉴定菌种;本文第三章通过建立五灵脂菌群-蒲黄双向发酵体系、五灵脂菌群-人参总皂苷转化体系,检测发酵前后蒲黄中黄酮类物质及人参总皂苷中的化学成分变化,探索五灵脂来源菌群的部分功能。结果:1.市购21批五灵脂需氧菌总数范围为10～106 cfu/g,霉菌及酵母菌总数范围为10～104cfu/g;11份未醋制五灵脂样品中大肠埃希菌、沙门菌检查结果均阳性,10份醋制五灵脂中大肠埃希菌检测结果均为阴性,沙门菌检查结果均阳性;21份药材水煎液均未检出大肠埃希菌及沙门菌。炮制方法及用药方式对五灵脂中微生物影响的实验结果表明,醋制及水煮可显著降低五灵脂药材中需氧菌、霉菌及酵母菌总数,醋制可消除五灵脂中大肠埃希菌污染影响、对沙门菌无影响,水煮可灭活五灵脂中沙门菌。2.本课题通过16S高通量测序共获得285218条长度分布在400～450 bp的高质量序列,经分析发现10份样本中微生物分布于不同的8个门、28个科、75个属共120种细菌。在门水平上,厚壁菌门(87.68%± 2.68%)、拟杆菌门(7.62%±3.74%)为优势菌门;在属水平上发现大量产短链脂肪酸相关菌;通过对五灵脂中微生物培养,共分离出22株细菌单菌落,包括乳杆菌属1株、芽孢杆菌属13株、肠球菌属4株、埃希氏菌属4株;分离出36株真菌,经鉴定为5个属7个种,包括曲霉菌属、刺盘孢属、镰刀菌属、假壳梭孢属、黑孢霉属。3.五灵脂菌群-蒲黄共发酵体系发酵前后蒲黄中黄酮类成分指纹图谱相似度超过99%,说明本课题从五灵脂中分离的细菌及真菌对蒲黄中黄酮类成分影响极小;在五灵脂菌群-人参总皂苷转化体系中,检测结果表明烟曲霉可将人参总皂苷中含量最高的人参皂苷Re转化为人参皂苷Rg1,发酵5天平均转化率达35%。结论:1.本课题发现五灵脂中存在大量有氧条件下可培养的微生物,市售的五灵脂干燥药材中存在大肠埃希菌及乙型副伤寒沙门菌污染,临床口服用药时常以醋制品和水煎剂的方式入药,可消除大肠埃希菌、沙门菌污染带来的健康隐患。2.高通量测序结果发现五灵脂携带的天然菌群以厚壁菌门、拟杆菌门为主,存在大量产短链脂肪酸相关菌,该类细菌与人类健康关系密切,另外功能预测结果表明菌群与能量代谢高度相关,以糖代谢为主,如糖酵解、糖异生等;同时,经平板划线法从五灵脂中分离的可培养微生物包括22株细菌及35株真菌,细菌分布于乳杆菌属、芽孢杆菌属、肠球菌属及埃希氏菌属,真菌经鉴定为曲霉菌属、刺盘孢属、镰刀菌属、假壳梭孢属、黑孢霉属。3.五灵脂菌群-蒲黄双向发酵体系中黄酮类成分指纹图谱结果表明从五灵脂中分离的可培养微生物对蒲黄中黄酮类物质转化无影响;五灵脂菌群-人参总皂苷双向发酵体系结果表明烟曲霉可将人参皂苷Re较高效率地转化为活性更强的人参皂苷Rg1,可作为人参皂苷类成分生物转化的菌种。