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谷胱甘肽(GSH)是普遍存在于植物、动物和其它生物体内的活性三肽。分子结构中的活性巯基具有重要的生物学功能,使其能络合金属离子,降低重金属对细胞的毒害。且其作为一种抗氧化剂,能够清除重金属毒性产生的活性氧自由基。所以,提高GSH的含量能够提高生物体对重金属的耐受性。GSH是由谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)口谷胱甘肽合成酶(GS)催化合成,但y-GCS的催化活性受产物GSH的反馈抑制,使得细胞内GSH含量维持在一定水平。根据文献报道,在某些革兰氏阳性菌中存在一种具有y-GCS和GS两种活性的双功能融合蛋白y-GCS-GS,研究发现该酶不受GSH的反馈抑制。所以该酶的表达能够使细胞合成大量的GSH。本研究中,通过一系列生物信息学网站及软件对嗜热链球菌(S.thermophilus) StGCS-GS基因编码的γ-GCS-GS进行预测分析表明,该蛋白分子量为85.1kD,理论等电点为4.90,平均疏水值为-0.268。该蛋白含有一个ATP结合位点,且具有Glu_cys_ligase和CPSase_L_D2亚家族保守域。同源比对发现嗜热链球菌y-GCS-GS的氨基酸序列与唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、血链球菌(Streptococcus sanguinis)和无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)γ-GCS-GS序列的相似性分别为93%、73%和63%。进化树分析表明它们的亲缘关系也相对较近。蛋白质三维结构预测表明它们的γ-GCS-GS具有相似的空间构架,推测其行使相似的功能。为了研究StGCS-GS基因在原核系统中的表达情况及其在重金属胁迫下的抗性功能,本实验将含有重组质粒pETG-10A+GCS-GS的大肠杆菌通过IPTG诱导,经Ni2+-NTA亲核层析柱纯化后获得了高纯度的融合白。经Western blot检测,纯化后的蛋白为His-y-GCS-GS融合蛋白。对转化大肠杆菌进行不同浓度Cd2+、Ni2+、Cu2+胁迫的耐受性测试。结果发现,在1mM CdCl2、2mM NiSO4胁迫条件下,转化大肠杆菌的生长状态明显优于对照,但在Cu2+胁迫条件下,两者没有明显区别。表明StGCS-GS基因的表达能够提高大肠杆菌对Cd、Ni的抗性,在其逆境胁迫下的生长发挥重要作用。为了进一步研究StGCS-GS基因是否赋予转基因酵母在不同非生物胁迫下的抗性功能及其在酵母细胞中的表达定位情况,实验将StGCS-GS基因构建到酵母表达载体pYES2上,并转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) INCScl菌株中。检测转基因酵母在不同胁迫培养基上的存活率。结果表明：在不同浓度的CdCl2、NiSO4及H202胁迫下转StGCS-GS基因的酵母的生长状态要好于对照。在CdCl2胁迫下表现的耐性更加明显。但在CuCl2和Sorbitol胁迫下,并未表现出耐受性。这说明StGCS-GS基因的表达使得转基因酵母具有抗Cd、Ni及氧化胁迫的能力。此外,利用y-GCS-GS-GFP融合蛋白对目的蛋白进行了表达定位研究,结果表明融合蛋白定位于酵母的细胞质中。为了进一步研究StGCS-GS基因的表达是否能提高高等植物的在重金属胁迫下的耐受能力。实验对9个相互独立并稳定表达y-GCS-GS的转基因烟草T3代株系进行了重金属胁迫耐受性分析。通过对野生型和转基因烟草在Cd、Ni、Cu胁迫后的根长、鲜重及叶绿素的统计分析表明,在不同浓度的Cd2+和Ni2+胁迫下,转基因烟草的生长状态都要优于野生型。但在Cu2+胁迫下,转基因烟草并未表现比野生型更好的耐受性。说明StGCS-GS基因的表达赋予了转基因烟草抗Cd和Ni胁迫的能力。另外,对γ-GCS-GS-GFP融合蛋白在拟南芥悬浮细胞中的表达定位研究表明该蛋白能够在细胞中表达。